硫酸可以溶液核酸

核酸中的有机无机磷酸——→无机磷酸+钼酸——→磷钼酸+还原剂（抗坏血酸等）——→钼兰

钼兰的最大吸收波长在660nm,在一定浓度范围内,溶液的吸收值与无机磷的含量成正比.该法测得的是总磷量,需减去无机磷的含量才是核酸的含磷量.

（二）定糖法

核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物,醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物,可用比色法或分光光度法测定其溶液中的吸收值,在一定浓度范围内,溶液的吸收值与核酸的含量成正比.

1、核糖的测定

生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值.

2、脱氧核糖的测定

DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸,该化合物可与二苯胺生成兰色化合物,在λ=595nm处有最大吸收值.

（三）紫外吸收法

根据核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环在λ=260nm处有最大吸收值,可采用紫外分光光度法测定核酸的含量.

病毒是没有无完整细胞结构的

它只有在细胞内生存

就不说人了，你扔一个动物到浓硫酸里试试

硫酸具有强腐蚀性

光脱水这一项，病毒就活不了了

还有硫酸可以让蛋白质变异

病毒就是主要由核酸和蛋白质外壳构成的

外壳都没了还不死吗

病毒是没有无完整细胞结构的，

它只有在细胞内生存，

就不说人了，你扔一个动物到浓硫酸里试试

硫酸具有强腐蚀性，

光脱水这一项，病毒就活不了了，

还有硫酸可以让蛋白质变异，

病毒就是主要由核酸和蛋白质外壳构成的

外壳都没了还不死吗。

在时被还原成蓝色的钼蓝。据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。

2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生乳白色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。

3.戊糖 核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物。脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺作用生成蓝色物 。

定磷试剂：按顺序A：B：C：蒸馏水＝1：1：1：2（V/V）混匀，现配。A、17% H2SO4：　将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸馏水中。C、10%Vc：10g Vc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。

、RNA组分的鉴定（试管内反应）：① 嘌呤碱：

水解液1ml+过量浓氨水+1ml AgNO3溶液→观察溶液变化。② 核糖：

水解液1ml+ FeCl3-浓HCl 2 ml+苔黑酚溶液0.2ml，水浴加热→观察溶液颜色。③ 磷酸：

水解液1ml+定磷试剂1ml，水浴加热→观察溶液颜

首先应该确定欲配制溶液的体积。假设是1000毫升。

然后确定用于稀释的浓硫酸的浓度。假设的98%的浓硫酸，浓度是18.4mol/L。

那么需要浓硫酸的体积是0.5×1000/18.4=27.2毫升

即量取浓硫酸27.2毫升，在搅拌的同时缓慢地加入到900毫升水中，最后加水定容至1000毫升即可。

用硝酸银鉴定嘌呤碱基属于核酸的定性分析

【目的】

1 ．掌握测定核酸 的组成从而 定性分析 DNA 或 RNA 的方法。 2 ．熟悉测定核酸的组成从而定性分析 DNA 或 RNA 的 原理。

【原理】

RNA 和 DNA 均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（ RNA 中的核糖与 DNA 中的脱氧核糖）和磷酸。水解产物可用下列方法鉴定。 1 ．嘌呤碱的鉴定原理

嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。

2 ．核糖的鉴定原理

核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与 3 ， 5- 二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。该反应需三氯化铁作为催化剂。

3 ．脱氧核糖的鉴定原理

脱氧核糖在浓酸中脱水生成 ω- 羟基 γ- 酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。

4 ．磷酸的鉴定原理

定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。

【器材】

1 ． 试管与滴管

2 ． PH 试纸

3 ． 沸水浴

4 ． 带有长玻璃管的胶塞

【试剂】

1 ． 5% 硫酸

2 ． 5% 硝酸银溶液

3 ．浓氨水

4 ． 3,5- 二羟甲苯试剂

取 FeCl 3 ·6H 2 O 1.0g 溶于 6ml 水中，加浓盐酸 100ml ，混匀，此为 A 液。另配制 6%3,5- 二羟甲苯乙醇溶液为 B 液。临用时用 A 液 100ml 加 B 液

3.5ml 混合即可。

5 ．二苯胺试剂

取二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰乙酸中，加浓硫酸 2.75ml 。此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。

6 ．钼酸试剂

取钼酸铵 2.5g 溶于 20ml 水中，加浓硫酸（ A·R ） 8.5ml, 冷却后再加水至 100ml ，放冷处可保存 4 周左右。

7 ．氨基萘酚磺酸溶液

取 15% 亚硫酸氢钠溶液 195ml 与 20% 亚硫酸钠溶液 5ml 混合，加氨基萘酚磺酸 0.5g ，在热水浴中搅拌使固体溶解（如不全溶，可滴加 20% 亚硫酸钠数滴，至多不超过 1ml 即可）。此溶液置冷处可保存 2-3 周，如颜色变黄需重新配置，临用前将上述溶液以蒸馏水稀释 10 倍应用。

8 ．核酸样品

称取粗制核酸样品 10mg/ 每组。或者，取本教材实验九从动物组织中提取出的核酸作为本次实验的样品。

【操作】

1 ．核酸的水解

向加入 10mg 核酸样品的试管（或者，向有核酸沉淀的离心管）中加入 5% 硫酸 4ml ，用玻璃棒搅匀，再用带长玻璃管的塞子塞紧管口，于沸水浴中加热 15min ，既得核酸的水解液。

2 ．核酸的鉴定

（ 1 ）嘌呤碱的鉴定：取小试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表依次加入试剂，混匀，放置 15min ，观察嘌呤银沉淀的生成，并记录颜色。

注：加氨水（约 2 ～ 3 滴）以中和酸，呈碱性即可，需用 PH 试纸测试。若加氨水过多，则生成银氨络离子 [ Ag(NH 3 ) 4 ] + ，使银离子减少，嘌呤银沉淀减少。

（ 2 ）核糖的鉴定：取试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表操作：

将两管同时放入沸水浴加热 15min ，观察颜色变化并记录。（煮 3 ～ 5min ，即可先观察）

（ 3 ）脱氧核糖的鉴定：取试管 2 支。分别标明测定与对照。按下表操作 :

将两管同时放入沸水浴中加热 10min ，观察颜色变化并记录。

（ 4 ）磷酸的鉴定：取试管 2 支，分别标明测定与对照，按下表操作：

于室温放置 10min 后，观察颜色变化并记录。

【注意事项】

1 ．为了安全，核酸水解时，避免将 长玻璃管的管口对准人 。

2 ．嘌呤碱的鉴定中氨水不能加的过多。

2、 pH影响：般缓冲液pH调节7.4-7.8较用7.8实验表明若pH7.5-8.0酶力定100%体系偏碱（pH8.3）仅全部力65%；体系偏酸（PH6.9）仅全部力40%

3、 ATP浓度影响：连接缓冲液ATP浓度0.5-4mmol/L间较用1mmol/L研究发现ATP适浓度0.5-1mmol /L浓抑制反应例5mmol/LATP完全抑制平末端连接黏端连接10%抑制；报道ATP浓度0.1mmol/L 磷酸载体自环比例由于ATP极易解所连接反应失败除DNA与酶问题外应考虑ATP素含ATP缓冲液应于 -20℃保存溶化取用立即放连接缓冲液体积较管贮存防止反复冻融引起ATP解与限制酶缓冲液同含ATP连接缓冲液 期放置往往失效所自行配制含ATP缓冲液（期保存）临用加入新配制ATP母液

4、 连接温度与间影响：黏性末端DNA双链间氢键作用所温度高使氢键稳定连接酶适温度恰37℃解决矛盾经 综合考虑传统连接温度定16℃间4-16h现经实验发现于般黏性末端说20℃ 30min足取相连接效间充裕20℃ 60min能使连接反应进行更完全些于平末端用考虑氢键问题使用较高温度使酶力更发挥

5、 酶浓度影响：使用DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍连接平末端酶用量要比连接黏端10-100倍进行黏末端连接需先行稀释稀释液与酶保存缓冲液相同或类似稀释液酶能间保持力便于随取用

6、 DNA浓度影响：要求环化效连接产物 DNA浓度高般超20nmol/L要求线性化连接产物 DNA浓度高些至少接近推荐浓度用质粒载体进行片段克隆及双酶切片段连接反应DNA浓度应降低甚至DNA总浓 度低至几nmol/L另据研究T4 DNA连接酶DNA末端表观Km值1.5nmol/L所连接DNA浓度应低于1nmol/L即应具2nmol/L末端浓度