提取RNA时，最后为什么要用75%乙醇洗涤

洗涤RNA中的盐离子。RNA提取是指从样品中纯化RNA的过程，提取rna时80乙醇的作用是洗涤RNA中的盐离子。乙醇在常温常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，低毒性，纯液体不可直接饮用。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

参考资料来源：百度百科-RNA

提取RNA时如何去除DNA的污染的方法：

注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有

问题。发现DNA污染，用DNAse I 消化1小时，37度

离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。

直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。

RNA提取步骤：

1. 匀浆处理：

① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。

② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项：

从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg 。

异丙醇是可以沉淀DNA的。后续或者前面应该有分离掉DNA的方法，因为DNA假如你是真核的话，通常是染色体的形式出现，分子量很大的，很容易沉淀下来，但是RNA的分子量就比较小，从而产生分离。

异丙醇可以沉淀RNA和蛋白质，其实。。。。假如很本质的看，都是差不多的，就是抢水。但是其还会让蛋白质变性，RNA什么的，不会，假如你不是研究什么二级结构的话。

异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，

氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧

异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。

DNA提取过程中，去除RNA的常用方法是乙醇沉淀。

因为RNA不溶于醇，乙醇能够消除RNA的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na⁺之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。

因此，只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。

扩展资料

RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3'，5'磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。

天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。

RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。