Cas9蛋白的两个结构域的作用

最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！

一、CRISPR/Cas9系统的构成

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。

Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。

二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制

CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：

一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。

第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！

详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。

一、什么是CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。

C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。

1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）

CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。

①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。

②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。

③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。

2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。

Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。

依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。

第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。

第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。

目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。

二、CRISPR-Cas9的作用原理

对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。

1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）

CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。

新间隔序列的获得可能分为三步：

第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。

第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。

第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。

2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）

CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。

3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。

随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。

三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…

tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR-Cas9的广泛应用

1、基因敲除（Knock-out）

Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除

2、基因敲入（Knock-in）

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率

3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）

Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

4、多重编辑（Multiplex Editing）

将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

5、功能基因组筛选

利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

CRISPR Cas9 -- C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats CRISPR- A ssociated P roteins 9

Crispr-CAS9系统最初在细菌和古生菌中观察到，作为一种适应性微生物免疫系统，提供对外来病毒和质粒的获得性免疫；已测序物种中，40%的细菌和90%的古生菌可观察到CRISPR基因座，且细菌中可能存在一个以上的基因座。

入侵的外来DNA被Cas核酸酶切割，然后以间隔序列的形式被保守的重复序列捕获并整合到crispr位点，所获得的间隔物作为创建短CRISPR RNA（crRNAs；create short CRISPR RNAs ）的模板，它与反式激活cRNA（tracRNA；trans-activating crRNA ）形成复合物；它们一起起到引导链的作用，将cas9核酸酶导向互补的入侵DNA（3）。一旦结合，cas9蛋白通过其HNH和RuvC-like核酸酶结构域分别切割“crRNA互补”及反义链。

文献中已描述45个不同的cas蛋白家族，每一个家族在合成cRNA、整合新的间隔序列和切割入侵DNA中具有不同的作用。CRISPR-Cas系统通常分为三类，这取决于Cas蛋白质序列和结构：I型、II型和III型。目前常用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统是一个Ⅱ型CRISPR-Cas系统，它是从化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）改编而来的。

内切酶是化脓性链球菌产生的细菌CAS9核酸酶蛋白。CAS9核酸酶具有两个DNA剪切结构域（Ruvc1和HNH-like核酸酶域），可剪切双链DNA使双链断裂（DSB；double strand breaks）。

gRNA是一种工程化的单链嵌合体RNA，结合了细菌tracrRNA的支架功能和细菌crRNA的特异性。gRNA 5'端的最后20bp作为一个归位装置，通过RNA-DNA碱基配对，将CAS9/GRNA复合物招募到PAM(protospacer adjacent motif )上游特定的DNA靶位。不同菌株和不同类型的CRISPR-Cas蛋白之间的PAM序列不同，化脓性链球菌Cas9的序列是5’-NGG。目前的CRISPR-CAS9系统可以直接用于任何5’-N20-NGG DNA序列，并产生精确的双链断裂。然后，通过在几乎所有细胞类型和生物体中发现的两种通用修复机制修复DSB：非同源末端连接（NHEJ；the non-homologous end-joining ）或同源定向修复（HDR；the homology-directed repair）。

NHEJ修复路径是一种容易出错的修复机制，用于在没有合适的修复模板的情况下修复双链断裂。NHEJ通路试图将DSB的切割端连接在一起。然而，这一过程往往导致DSB位点的插入或删除（indels）突变，导致移位或引入永久性破坏目标基因开放阅读框的成熟前终止密码子。尽管NHEJ的INDEL结果很大程度上是随机的，但是科学家们可以通过将gRNA定位于相关基因的N末端来确保最大程度的基因破坏；这将确保框架移位突变不会导致部分功能性基因产物。在利用NHEJ修复通路时，设计第一或第二外显子中的gRNA并避免靶基因的内含子区是一个很好的实践。

除NHEJ，细胞还能够利用一种更精确的修复机制，即同源定向修复（HDR）途径。这种修复机制可以用来引入特定的核苷酸修饰基因组DNA。在这种方法中，将与预期编辑位点上游和下游序列高度同源的DNA修复模板连同适当的gRNA和CAS9核酸酶一起引入细胞。在这种合适的模板存在下，不易出错的HDR机制可以通过重组忠实地对CAS9诱导的DSB站点进行所需的更改。在设计修复模板时，请确保目标序列没有紧跟PAM序列，或者PAM序列被排除或变异。这是为了避免使用相同的CRISPR-CAS9系统对修复模板进行降解。

CRISPR-CAS9系统可以通过gRNA的设计针对任何基因组区域的特异性取决于位于目标序列下游的PAM序列。作为细菌和古细菌免疫系统，PAM识别序列激活CAS9的核酸酶域，从而作为区分自我和非自我的手段（如：阻止CRISPR基因座被靶向）。

PAM识别序列因来源于CAS9核酸酶的细菌种类和类型而异。最常用的II型CRISPR系统使用来自化脓性链球菌的CAS9核酸酶。这种特殊的核酸酶在GRNA序列的3'端识别5'-NGG。其他市售CAS9可识别其他PAM序列。

Table 1 : PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.

Cas9 Nickase是Cas9的一种突变形式，其RuvC1 或HNH-like核酸酶域中分别有D10A 或H840A 突变，这种突变形式导致在目标位点产生单链刻痕而不是双链断裂。由于单链断裂（或缺口）通常使用完整的互补DNA链作为修复模板通过HDR 途径快速修复，因此Cas9 Nickase可将脱靶效应最小化。

为了利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA。这两个gRNA需设计在相反的DNA链上，但其距离很近，以确保一旦两个链被Cas9 Nickase切割，DSB就会被诱导。这对Cas9 Nickase修改减少了脱靶效应，因为需两个gRNA共同产生一个DSB。一旦形成DSB，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。

如果共同引入含有所需修饰的修复模板DNA与gRNA和Cas9 nickase，则Cas9 Nickase也可用于通过同源重组产生核苷酸修饰。

Table 2 : Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification

Cas9双突变体或Null突变体是通过突变野生型Cas9的两个切割结构域而产生的。 这种Cas9蛋白保留了通过gRNA：基因组DNA碱基配对与基因组DNA结合的能力。 与Cas9核酸酶和Cas9 Nickase可以实现永久性基因破坏不同，Cas9 Null突变体不引入任何基因组修饰。 通过将Cas9双突变体与其他效应蛋白融合，CRISPR Cas9系统可以将其作用扩展到基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀。

Table 3 : Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases

large size and G-rich PAM sequence

Cpf1于2015年底由麻省理工学院的Feng Zhang小组发现。在16种候选Cpf1蛋白中，两种在哺乳动物细胞中最具潜力的高特异性基因组编辑工具：asCpf1和lb2Cpf1。这些核酸酶在人类细胞中具有与常用spCas9相当的靶向切割效率。

Cpf1允许新的定位可能性，因为它识别富含T的PAM位点。与Cas9的富含G的PAM要求相比，这显着扩大了可能的基因组目标的范围。虽然Cas9可能是靶向富含G的区域的优选核酸酶，但Cpf1可用于靶向富含T的区域。在哺乳动物细胞中，Cpf1可以靶向如支架/基质附着区域和着丝粒DNA的难以延伸的DNA片段。使用Cpf1还可以探索由富含AT的结构域控制的细菌基因组，例如引起疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）。同样，在Cas9的表达有毒的情况下，Cpf1可能是Cas9的有用替代品，如在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和几种蓝细菌（Cyanobacteria）中所见。

Cpf1需要较短的guide RNA才能运作。虽然Cas9需要tracrRNA的存在来处理crRNA，但Cpf1可以自己处理pre-crRNA。这对于生物技术特别感兴趣，因为与用于Cas9的~100nt tracrRNA / crRNA杂交体相比，Cpf1可以仅用~42nt crRNA靶向。这将工程化sgRNA的大小减少了一半以上，同时还简化了与合成和化学修饰相关的方法和成本。这种自编辑功能也使Cpf1成为多重基因组编辑的最佳选择，因为更多的sgRNA可能适合一个载体。

另一个显着差异是Cas9在切割后产生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端。产生粘性末端的其他方法，例如限制酶消化，具有比Cpf1更短的识别序列，因此切割性较低。已经利用Cpf1的这种特性在体外进行高度特异性的DNA组装。在体内使用这种方法，科学家们可以对非分裂细胞（如神经元）进行DNA敲入，通过HDR进行基因组编辑尤其具有挑战性。

Cpf1切割PAM位点下游18-23bp的DNA，导致NHEJ修复双链DNA断裂后对识别序列没有破坏。导致Cpf1能够进行多轮DNA切割，并且增加了进行所需基因组编辑的机会。相比之下，由于Cas9仅在PAM位点上游切割3bp，因此NHEJ途径导致indel突变，其破坏识别序列，从而防止进一步的切割轮次。理论上，重复的DNA切割轮次应该导致Cpf1导致靶基因的沉默增加，并且在敲入实验的情况下，发生同源定向修复的机会更大。

Zhang等人的一项研究。表明Cpf1介导的基因组编辑可用于纠正诱导多能干细胞和小鼠的肌营养不良基因突变。这导致基因表达恢复，小鼠症状得到纠正。 Cpf1也已成功用于蛋白质-sgRNA复合物中，以突变大豆和烟草植物中的基因。

虽然化脓性链球菌Cas9（S. pyogenes Cas9spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶，但最近的注意力已转向从金黄色葡萄球菌中分离的微型Cas9核酸酶（S. aureussaCas9）。这种小核酸酶通过使生物体内基于CRISPR的基因编辑更加可行，具有改变生物医学研究产业的巨大潜力。 SaCas9和spCas9能够以相当的效率在体内切割真核DNA。但saCas9具有几个特性，使其对某些应用更有用。

SaCas9比spCas9小约1kb，使其能够更有效地包装到较小容量的腺相关病毒（AAV）中，为调控元件，crRNAs和tracrRNAs留下额外空间。通过将Cas9和sgRNA包含在一个构建体（称为All-In-One载体）中，可以在一个转染/转导步骤中完成Cas9表达和sgRNA靶向。由于其低免疫原性和选择性感染某些组织类型的能力，AAV是用于体内研究的优选基因递送方法。

同样，与spCas9相比，saCas9为基因组编辑开辟了新的可能性，因为它具有不同的定位能力。 spCas9识别5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9识别5'-NNGRRT-3'。可用于PAM序列的更多种类意味着可用于基因组编辑的增加的基因座数量。当需要使用同源定向修复精确编辑基因时，这是特别有益的，因为当识别序列非常接近待编辑区域时HDR最有效。

saCas9较长的PAM的一个缺点是，该序列在基因组中的发生频率低于spCas9的PAM序列，限制了其潜在的效用。 然而，saCas9较长的PAM序列应该有助于防止脱靶的切割，因为它具有更高的特异性。

麻省理工学院张实验室于2015年进行的一项研究调查了体内saCas9的表现。 他们将携带saCas9的AAV注射到小鼠体内以破坏PCSK9基因，该基因与家族性高胆固醇血症有关。 这导致1周后肝组织中基因修饰>40％，注射后4周没有毒性迹象。 最近的其他工作已经用于开发具有使用分子进化的松弛PAM识别特异性的变体saCas9。 与野生型saCas9相比，这种变体允许更大范围的潜在编辑目标，同时保留其小尺寸传达的优势。

锌指核酸酶（Zinc-finger NucleasesZFNs）

转录激活因子样效应核酸酶（Transcription Activator-Like Effector NucleasesTALENs）

Table 4 : Comparison of current genome editing technologies

An Intro to CRISPR Cas9