测酶为什么加甲苯

土壤酶有多种存在部位及状态，其中胞内酶存在于微生物细胞内部，其直接反映了微生物活动情况，对外界刺激因素更加敏感，变化幅度较大；而胞外酶与土壤有机质、粘粒等紧密结合在一起，其性质比较稳定，对农业技术措施、环境条件及有毒物质等变化的反应规律性更强。但通常测得的酶活性是胞内酶还是胞外酶是一个重要问题。因此区分胞内、胞外组分各自对土壤酶贡献的研究是十分有意义的。

但是，由于土壤酶在土壤中的来源繁多、存在状态多变、存在结构复杂，及人们对土壤酶认识的不够深入及现阶段的科学仪器和试剂的限制，使得人们对土壤胞内、胞外酶等组分的比例关系以及各组分对微生物生物量贡献等问题尚不十分明确。所得结果不尽一致，使微生物代谢活性（胞内酶活性）和这些胞外酶活性分离的实验迄今没有有效实现。

本论文拟通过模拟方法，采用多种方法尝试区分土壤胞内、胞外酶，对各部分酶的性质和关系进行了较为系统的研究，并借助动力学手段对酶进入土壤后的变化过程和机理进行了分析，结果表明：

1.灭菌后的土壤载体能降低芳基硫酸酯酶纯酶的酶促反应初速度，粘粒含量越高，其对纯酶的抑制作用越强。随着载体浓度的增加，Km值呈增大趋势，Vmax、Vmax/Km、k值呈降低趋势，载体对芳基硫酸酯酶的作用机理为混合抑制，即土壤对酶的吸附同时发生在酶的活性位点及非活性位点上。通过载体对芳基硫酸酯酶的酶促反应初速度及动力学参数可以推断出，四种类型土壤对酶吸附能力从强到弱顺序依次为：红壤>塿土>褐土>风沙土；粘粒含量的高低是影响酶促反应的主要因素。

2.甲苯对芳基硫酸酯酶纯酶具有明显的抑制作用，降幅最大达到45.5%；土壤载体对溶液中的纯酶有很强的吸附能力；1.0μL g-1甲苯即可完成对土壤中酶活性的激活作用，增幅达9%～198%；随甲苯浓度增加，土壤酶活性的变化幅度逐渐趋缓，其可用Langmuir模型较好地拟合，并由此获得了最大表观酶活性Umax，其与土壤性质等达到了显著相关；揭示出甲苯主要是通过杀死土壤中的微生物来影响土壤酶活性的；在供试土样中土壤芳香硫酸酯酶胞外酶和胞内酶平均分别占54.4%和45.6%。，高肥力土壤对酶较强的吸附能力使得其胞外酶含量均高于低肥力土壤。

3.氯仿熏蒸对芳基硫酸酯酶纯酶有较强的抑制作用，熏蒸12h时的抑制作用最强，氯仿熏蒸处理能显著增强土壤芳基硫酸酯酶活性，增幅为25%～454%。传统的熏蒸土壤24h的时间过长，由拟合方程计算出的理论最适熏蒸时间为16～17小时。由最大表观酶活性初步计算了土壤胞内、胞外芳基硫酸酯酶的比例关系，供试土样胞内酶含量要大于胞外酶含量。

4.诱导物质的加入显著增强了土壤微生物量碳及芳基硫酸酯酶活性，土壤酶活性的变化与土壤肥力和微生物数量密切相关。土壤诱导酶活性的增加是微生物活动引起的，因此土壤微生物对底物诱导的反应比土壤酶更敏感更直接，故土壤微生物量碳含量的增幅要大于土壤芳基硫酸酯酶活性。线性方程可较好表征土壤微生物量碳与芳基硫酸酯酶活性间的变化关系，并通过截距计算出土壤的胞内、胞外酶关系。土壤微生物也是土壤肥力的组成部分，因此用总酶活性来评价土壤肥力要比胞外或胞内酶活性更加准确。

5.芳基硫酸酯酶纯酶对微波有一定的耐受力，不考虑温度的影响时，当微波功率低于纯酶的耐受极限值时（240W），纯酶不受影响；当功率高于极限值时，随功率的增加纯酶活性逐渐降低。微波照射时间越长对土壤芳基硫酸酯酶活性的抑制作用越强，土壤温度的剧烈变化是微波照射后土壤酶活性降低的主要原因之一。根据计算得出酶活性降低50%所用微波照射时间（ET50）显示，肥力越高的土壤对微波照射越敏感。土壤芳基硫酸酯酶对微波有一个最敏感的照射功率，此时土壤酶活性的变幅最大，且这个敏感功率与纯酶的极限功率比较接近。分析表明粉粒含量越高的土壤对微波照射越敏感，揭示出土壤粉粒是吸收微波能量的主体。

（1）用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液。

（2）每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.

（3）样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L).

ALP标准曲线绘制:

取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次稀释到160 umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.

【结果】测定碱性磷酸酶的含量

还有其他方法来测定，比如

以ALP为目标物的检测方法有

1 Gomori钙钴法

2偶氮偶联法

3碱性磷酸酶染色试剂盒法。

4.PNPP偶氮法

5. BCIP/NBT比色法

6 茜素红法

7. von Kossa法

1、将粉末状的底物（2g）放入l20ml烧杯中，加入4ml乙醇或工业甲基化酒精（IMS）。

2、用磁力搅拌器充分混合，打碎所有的块状底物。

3、然后加入96ml磷酸钠缓冲液(100mM.pH7.0；BufferA)，再次充分搅拌直到底物全部溶解。

4、用玻璃棒驱散任何粘住烧杯边缘的偶氮酪蛋白，溶解完全的溶液保存于可密封的容器中。

5、加入2滴甲苯以防止微生物的wu染，4C下保存，可以保存数周。

分离：利用高速冷冻离心法。

纯化：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

Km：达到最大反应速度一半时的底物的浓度，注意各个参数的控制。

在制备过程中勿使蔗糖酶失活。

操作步骤：称5 g风干土置于200 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，加入20 mL0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液，中性的磷酸盐用柠檬酸盐缓冲液），仔细 匀后放入恒温箱，在37℃下培养12 h。取培养后的滤液5 mL，并按绘制标准曲线所述方法显色。（置于50 mL容量瓶中，分别加入20mL蒸馏水。再加入0.25 mL缓冲液、0.5 mL 4-氨基安替比林液，0.5 mL铁氰化钾液。每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50 mL.在15 min内，在分光光度计上于510 nm处比色测定溶液的光密度）。比色测定。该实验以酚工作液的不同浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 结果计算：磷酸酶活性，以24 h后1 g土壤中释出的酚毫克数表示。

酚（mg）=a*(V1/V2)*(100/W)*0.32*2.29) 式中a----滤液中酚的毫克数；V1----磷酸苯二钠体积数；V2-----所取的滤液体积数； W-----风干土土重；0.32----以磷单位表示结果的系数（在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚相当于0.32重量单位的磷）； 2.29----将P换算为P2O5的系数

基于两种互不相溶的液体二元体系的沸点低于各组分的沸点这一事实，将食品中的水分与甲苯或二甲苯或苯共沸蒸出，冷凝并收集馏液，由于密度不同，馏出液在接收管中分层，根据 馏出液中水的体积，即可计算出样品中水分含量。

蒸馏法的原理是：将不溶于水的有机溶剂和样品一起放到蒸馏瓶中加热，样品中的水分与有机溶剂共同沸腾，汽化，把水和有机溶剂收集到一个刻度管中，最后读出水层。

不过如果样品是对热不稳定的，一般不用二甲苯，而采用沸点低的苯或甲苯。

此方法一般适用于含有大量挥发性成份的样品，如香料、调味品等，禾业科技专专门做水分测定的。

因为其在水中水浴的时候才真正的开始了,酶反应,控制时间主要是为了确保每个试管的反应进度是一样的.这样在同一个基准下,才可以进行研究.