硫酸酯酶的主要分类

乙醚是工业常见的原料，所以实验室一般都是买的，制取乙醚的实验也是上课用的，并不是说实验室的乙醚就是这么生产的！

课堂上，制取乙醚的实验是这样的，首先器材：大试管、导管、带导管和温度计的木塞、橡胶管、烧瓶、铁架台、铁圈、石棉网、酒精灯、分液漏斗。药品：浓硫酸、无水乙醇、饱和碳酸钠溶液。

步骤：先将发生装置连接好，将铁圈固定在铁架台上，然后将石棉网放在铁圈上，酒精灯放在下面烧瓶放在石棉网上，然后导管和木塞上的导管用橡胶管连接，将木塞塞在烧瓶上，检验气密性。然后装药，将无水乙醇倒入烧瓶中，在缓缓倒入浓硫酸，之后塞上木塞(温度计的水银球要浸入液面以下)，然后将饱和碳酸钠溶液倒入大试管中，将导管放入大试管，但导管口不能浸入液面一下！然后点燃酒精灯，看着温度计，保持混合液体的温度在140℃左右就行了，加热的过程中，可能会产生乙烯，不过没关系，只有一点点！加热一段时间后，大试管在会有一些无色液体漂在碳酸钠溶液上，这就是乙醚，这时，可以停止加热了，记住先拿出导管，再熄灭酒精灯！乙醚虽然可以和水混合，但是在高难度的碳酸钠溶液中几乎不溶，所以之后将大试管中的液体倒入分液漏斗中进行分液就行了！

工业上制取乙醚的方法有好多种，主要是三种：一种是以硫酸为吸收剂的间接水合法；另一种是乙烯催化直接水合法；还有一种是氧化铝催化乙醇的方法！

①间接水合法，也称硫酸酯法，反应分两步进行。首先，将乙烯在一定温度、压力条件下通入浓硫酸中，生成硫酸酯，再将硫酸酯在水解塔中加热水解而得乙醇，同时有副产物乙醚生成。间接水合法可用低纯度的乙醇作原料、反应条件较温和，乙烯转化率高，但设备腐蚀严重，生产流程长，已为直接水合法取代。

②直接水合法，是在一定条件下，乙烯通过固体酸催化剂直接与水反应生成乙醇

③工业上可在氧化铝催化下 ，于300℃左右由乙醇分子间失水制得。

臭氧化反应

苯在特定情况下也可被臭氧氧化，产物是乙二醛。这个反应可以看作是苯的离域电子定域后生成的环状多烯烃发生的臭氧化反应。

在一般条件下，苯不能被强氧化剂所氧化。但是在氧化钼等催化剂存在下，与空气中的氧反应，苯可以选择性的氧化成顺丁烯二酸酐。这是屈指可数的几种能破坏苯的六元碳环系的反应之一。（马来酸酐是五元杂环。）

这是一个强烈的放热反应。

其他

苯在高温下，用铁、铜、镍做催化剂，可以发生缩合反应生成联苯。和甲醛及次氯酸在氯化锌存在下可生成氯甲基苯。和乙基钠等烷基金属化物反应可生成苯基金属化物。在四氢呋喃、氯苯或溴苯中和镁反应可生成苯基格氏试剂。

苯不会与高锰酸钾反应褪色，与溴水混合只会发生萃取，而苯及其衍生物中，只有在苯环侧链上的取代基中与苯环相连的碳原子与氢相连的情况下才可以使高锰酸钾褪色（本质是氧化反应），这一条同样适用于芳香烃（取代基上如果有不饱和键则一定可以与高锰酸钾反应使之褪色）。这里要注意1，仅当取代基上与苯环相连的碳原子；2，这个碳原子要与氢原子相连（成键）。

至于溴水，苯及苯的衍生物以及饱和芳香烃只能发生萃取（条件是取代基上没有不饱和键，不然依然会发生加成反应）。

苯废气处理也是及其重要的。

光照异构化

苯在强烈光照的条件下可以转化为杜瓦苯（Dewar苯）：

杜瓦苯的性质十分活泼（苯本身是稳定的芳香状态，能量很低，而变成杜瓦苯则需要大量光能，所以杜瓦苯能量很高，不稳定）。

在激光作用下，则可转化成更活泼的棱晶烷：

棱晶烷呈现立体状态，导致碳原子sp3杂化轨道形成的π键间有较大的互斥作用，所以更加不稳定。

引发剂种类很多，在胶黏剂中常用的是自由基型引发剂，包括过氧化合物引发剂和偶氮类引发剂及氧化还原引发剂等，过氧化物引发剂又分为有机过氧化物引发剂和无机过氧化物引发剂。

1、有机过氧化物引发剂

有机过氧化合物的结构通式为R—O—O—H或R—O—O—R,R为烷基、酰基、碳酸酯基等。.

有机过氧化合物分为如下6类

(1)酰类过氧化物(过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰)。

(2)氢过氧化物(异丙苯过氧化氢、叔丁基过氧化氢)。

(3)二烷基过氧化物(过氧化二叔丁基、过氧化二异丙苯)。

(4)酯类过氧化物(过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化叔戊酸叔丁基酯).

(5)酮类过氧化物(过氧化甲乙酮、过氧化环己酮)。

(6)二碳酸酯过氧化物(过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯)。

有机过氧化物的活性次序为：二碳酸酯过氧化物>酰类过氧化物>酯类过氧化物>二烷基过氧化物>氢过氧化物。

2、无机过氧化物引发剂

无机过氧化合物因溶于水，多用于乳液和水溶液聚合反应，主要为过硫酸盐类，如过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵，其中最为常用的是过硫酸铵和过硫酸钾。

3、偶氮类引发剂

偶氮类引发剂有偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈，属低活性引发剂。常用的为偶氮二异丁腈，使用温度范围50～65℃，分解均匀，只形成一种自由基，无其他副反应。比较稳定，纯粹状态可安全储存，但在80～90℃也急剧分解。其缺点是分解速率较低，形成的异了腈自由基缺乏脱氢能力，故不能用作接枝聚合的引发剂。

偶氮二异庚腈活性较大，引发效率高，可以取代偶氮二异丁腈。而偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)引发活性适中，聚合反应易控，聚合过程无残渣，产品转化率高，分解产物无害，是偶氮二异丁腈(AIBN)的最佳替代品。

4、氧化还原引发剂

过氧化物引发剂和偶氮类引发剂分解温度较高(50～100℃)，限制了在低温聚合反应的应用。氧化还原引发体系是利用氧化剂和还原剂之间的电子转移所生成的自由基引发聚合反应。因此氧化还原引发剂较之热分解引发剂具有可以在较低温度(0～50℃)下引发聚合反应，其优点可以提高反应速率，降低能耗。可构成氧化还原体系的有过氧化苯甲酰/蔗糖、叔丁基过氧化氢/雕白块、叔丁基过氧化氢/焦亚硫酸钠、过氧化苯甲酰/N，N-二甲基苯胺。过硫酸铵/亚硫酸氢钠、过硫酸钾/亚硫酸氢钠、过氧化氢/酒石酸、过氧化氢/吊白块、过硫酸铵/硫酸亚铁、过氧化氢/硫酸亚铁、过氧化苯甲酰//N，N-二乙基苯胺、过氧化苯甲酰/焦磷酸亚铁、过硫酸钾/硝酸银、过硫酸盐/硫醇、异丙苯过氧化氢/氯化亚铁、过硫酸钾/氯化亚铁、过氧化氢/氯化亚铁、异丙苯过氧化氢/四乙烯亚胺等。其中叔丁基过氧化氢/焦亚硫酸钠反应速度最为适宜。

月桂醇硫酸酯钠的危害有：破坏皮肤内部的蛋白质、影响生育能力，甚至导致乳腺癌、增加口腔溃疡发病的几率。

1、破坏皮肤内部的蛋白质

当皮肤在超过0.5%的情况下，月桂醇聚醚硫酸钠的浓度过高，会使皮肤变干。这种物质破坏了那些保护皮肤表面长期存在的天然油脂，进而破坏皮肤内部的蛋白质，甚至破坏胶原蛋白，从而对皮肤产生一定的敏感性。

2、影响生育能力，甚至导致乳腺癌

月桂醇聚醚硫酸钠会通过皮肤轻易被人体吸收，然后进入肝脏，很难通过新陈代谢排出体外。长此以往，生育能力会下降，女性也有可能患上乳腺癌。

3、增加口腔溃疡发病的几率

如果将其用于牙膏，则可能增加口腔溃疡发病的几率。

月桂醇聚醚硫酸酯钠是一种常用于洗洁精、餐具洗刷、洗发露的中的物质。呈现为膏状或液体，且颜色各异。它的应用范围较广，它还适用于纺织、造纸、皮革、机械、石油等工业。

不带任何异味，易溶于水，具有良好的去污、乳化、起泡性和抗硬水性，生物降解性好。但是使用含有月桂醇聚醚硫酸酯钠过多的产品可能对人体有一定的危害。

具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤和抗HIV的作用。

通过对褐藻多糖硫酸酯药学、药理和毒理进行系统研究后，完成了Ⅱ期临床实验，

发现它对治疗肾病综合症和早、中期慢性肾衰效果好，无毒副作用，

特别对改善肾功能、降低血肌酐效果尤为明显。

中国科学院海洋研究所在国内外首先将褐藻多糖硫酸酯用于治疗肾病综合症和早期肾衰，

将生物试剂制成为药物，形成了我国具有独立知识产权的海洋新药。

1913年，Kylin首次从褐藻类的掌状海带（Laminaria digitata）里用稀酸提取的一种多糖，经水解后以苯腙分离出甲基戊糖，确定为L-fucose（L-岩藻糖），命名此类多糖为“Fucoidan”（岩藻聚糖）。后来的研究者在墨角藻、泡叶藻、裙带菜、羊栖菜、海蕴、厚叶解曼藻、海带等很多褐藻中都发现并分离出了岩藻糖（L-fucose）这种成分，所以就把这一类物质统统都称作“褐藻多糖硫酸酯”。再后来的较详细研究发现，从各种褐藻中提取的“褐藻多糖硫酸酯”不仅各种组分的含量有差异，有的所含物质的种类也有很大区别，这也就为准确区分命名造成了混乱。

要正确理解准确、规范的命名，首先有必要对藻类相关知识做一个了解，并正确掌握海藻多糖与褐藻多糖、褐藻多糖硫酸酯与岩藻聚糖硫酸酯的区别。

岩藻聚糖硫酸酯是一种优秀的健康食品、药品原料，因天然含有硫酸根，从而具有阴离子高分子化合物的特性。研究表明，岩藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性。岩藻聚糖硫酸酯是一种对巨噬细胞、T细胞有直接作用的免疫调节剂；具有明显的抗凝血和促纤溶的药理学活性；包含硫酸基的岩藻糖或其降解物能诱导癌细胞凋亡，可用作凋亡诱导剂和抗癌药；能诱发细胞生长因子的生成，从而促进各种细胞生长，修复受损坏或机能减退的器官和组织；由于其具有抗凝血的作用，所以适用于血粘度高的病人，可作为预防血栓形成的药物或保健品；它还具有良好的降血脂、降血糖、降胆固醇的功效，能克服降脂药物的一些副作用；可治疗慢性肾衰，对中早期肾衰效果显著，特别对改善肾功能，提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著；可作为金属离子的结合剂和阻吸剂，如可使人体对铅的吸收减少70%以上。

一般药理研究表明：100mg/Kg、300mg/Kg灌胃给药对麻醉犬血压、心电未有明显作用；400mg/Kg、800mg/Kg灌胃给药对小鼠神经系统未见明显影响。

急性毒性试验表明：小鼠一次静脉注射LD50为515.3±39.8mg/Kg；小鼠灌胃给药LD50>4g/Kg，大鼠灌胃给药LD50>4g/Kg。

长期毒性试验表明：以2.5、0.9、0.3g/Kg/日给大鼠灌胃给药6个月及恢复期一个月对血液学指标中除凝血时间明显延长外，对其它指标无明显影响。脏器系数、病理组织学检查也未发现明显病理变化。比格狗口服给药180天60mg/Kg为安全无毒剂量。

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）表明：岩藻聚糖硫酸酯对基因无致突变作用。

月桂硫酸酯钠是石油提炼的合成表面活性剂,是一种价格低廉的清洁剂,，常用于洗涤剂、餐具洗刷、洗发露中等，但使用含有月桂醇聚醚硫酸酯钠过多的产品会对人体造成一定伤害。

当月桂醇聚醚硫酸酯钠的浓度一旦超0.5%的时候，它们就会使皮肤变的干燥。这些物质会破坏保护皮肤表面的那些长期存在的自然的油脂，继而潜入皮肤内破坏里面的蛋白质，甚至会破坏胶原蛋白，从而对皮肤造成一定的敏感。

过量的月桂醇聚醚硫酸酯钠通过皮肤还很容易被身体吸收，进入人体内的肝脏，而这些成分难以通过新陈代谢将它排出体外，长期累积会降低人的生育能力，女性可能有患乳腺癌的风险。

用于牙膏中过多桂醇聚醚硫酸酯钠忽悠可能会增加患口腔溃疡病发的机率。

所以看似廉价的桂醇聚醚硫酸酯钠虽然清洁能力超强，但是日常生活中过量使用会对身体健康带来一定影响。

摘 要 本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。

关键词 多糖；提取；纯化；活性炭

多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。

另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。

由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。

1. 多糖的提取[12]

1.1 热水浸提法：

1.1.1多糖提取条件的优选

根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。

1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥

首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。

1.2 微波辅助提取法：

其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。

由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。

聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。

1.3 超声辅助法：

其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。

超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。

1.4 索氏提取法：

将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。

1.5 醇提法：

先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。

醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。

1.6 其它方法：

多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。

2. 多糖的纯化

2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。

2.1.1 除蛋白质

采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：

2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。

2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。

2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5－10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。

Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开[1]。

2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。

2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。

另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％，多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。

2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。

除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]。

2.1.2 除色素

2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。

2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素。

2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。

2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。

2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。

2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。

2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。

2.1.3 除低聚糖等小分子杂质

2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。

2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面2－3cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复3－4次。

2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：

2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。

2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。

2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。

纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。

纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。

凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。

亲和层析 用凝聚素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖。

高压液相层析

2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的，故可用电泳的方法将不同的多糖分开，电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状，用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，将多糖加于柱上端，接通电源，上端为正极（多糖的电泳方向是向负极的），下端为负极，其单位厘米的电压为1.2－2V，电流30－35MA，电泳时间为5－12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好，但只适合于实验室小规模使用，且电泳柱中必须有冷却夹层。

2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。

2.2.7 其它方法：纯化除采用上述方法外，还有超过滤法（多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离）、活性炭柱色谱。另据报道，国外多采用的LKB柱色谱系统，用比旋度、示差折射及紫外检测多糖，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。

2.3 多糖纯度的鉴定

2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关，故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时，如果是组分均一的多糖，则应呈现单峰。具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1％－5％的溶液，然后进行密度超离心，待转速达到恒定后（通常是60000r/min），采用间隔照明的方法检测其是否为单峰。

2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。多糖的组成不同、分子量不同，其与硼酸形成的络合物就不同，在电场作用下的相对迁移率也会不同，故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等。缓冲液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，电压强度约为30－50V/cm，时间是30－120min。由于电泳时会产生大量的热，所以要有冷却系统，将温度维持在0℃左右，否则会烧掉支持体。一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显，电泳后常用的显色剂是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和过碘酸希夫试剂等。

2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展开剂为0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液，柱高和柱直径之比大于40。

2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10％左右，离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为20％－25％，离心所得二次沉淀，比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品，否则为混合物。

2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法，即如为纯品两次分离所得产物的官能团如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠。

必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。