分析纯乙酸钠的含量测定方法

乙酸钠溶液中由于醋酸根离子水解而显碱性，

CH3COO- + H2O = CH3COOH + OH-

浓度不同，PH值也不一样，

但PH＞7是肯定的，

分析纯乙酸钠（500g）是固体，如果有PH值也大于7，但好象没这么说的。

检测食品中脱氢乙酸的国标方法有：气相色谱法、液相色谱法等，方法各有优缺点。

1、气相色谱法

该方法是在GB/T 5009.121-2003《食品中脱氢乙酸的测定》标准方法 上进行改进：将样品酸化后，用乙醚提取脱氢乙酸后浓缩，用气相色谱（附 氢火焰离子化检测器）进行分离测定，与标准系列比较定量。

1.1 实验部分

1.1.1 仪器与主要试剂

气相色谱仪：GC-2010（附氢火焰离子化检测器 FID），日本岛津公司。

脱氢乙酸标准品：纯度≥99.6%，购自美国。

乙醚：色谱纯，重蒸。

丙酮：色谱纯，重蒸。

脱氢乙酸标准工作溶液：准确称取脱氢乙酸标准品50mg，以丙酮溶解 定容于50mL容量瓶中，再以丙酮分别稀释至1μ g/mL、10μ g/mL、40μ g/mL、 80μ g/mL 120μ g/mL、160μ g/mL 200μ g/mL，配制标准工作溶液。

色谱条件：

色谱柱：DB-5 毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μ m）；

分流比：10：1，柱流速1.0mL/min

进样口温度：250℃、检测器温度：300℃、柱温165℃；

气流条件：氢气50mL/min、空气400mL/min、氮气40mL/min。

应用上述色谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样，色谱图如下：

1.1.1 样品处理 称取5～10g 试样（准确至0.0001g），加10mL 饱和氯化钠溶液，2mL 盐酸溶液（1+1）酸化，分别以50mL、20mL、20mL 乙醚提取三次，合并乙 醚层于100mL 容量瓶中定容后，分别用20mL 饱和氯化钠溶液、50mL 碳酸 氢钠溶液（10g/L）各洗涤一次，加10g 无水硫酸钠，室温下放置30min， 取 50mL 在 60℃水浴下用旋转蒸发仪浓缩至近干，用丙酮定容后供气相色谱测定。

1.1 方法讨论

1.1.1 色谱条件的选择

脱氢乙酸用气相色谱法测定，与其他同类功能的防腐剂如山梨酸、苯 甲酸、对羟基苯甲酸酯类都有很好的分离度，且在非极性柱、弱极性柱和 极性柱中都有很好的响应值。但在实验显示，脱氢乙酸在非极性柱中因低 柱温有色谱峰拖尾现象，在极性柱中因柱流失有基线漂移现象，为使定性 定量准确，选用了弱极性柱DB-5。

1.1.1 线性关系

在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在 0.5～100μ g/mL 范围内与 响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数 r=0.99995。脱氢乙酸的最低 检出浓度为0.2μ g/mL。

1.1.1 准确度与精密度

选用含脱氢乙酸的辣椒酱样品，在样品中添加不同浓度的脱氢乙酸标 液，按本方法测定，每一浓度重复测定6 次，取平均值，计算平均回收率 及变异系数，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意，相对标准 偏差范围小于10%，重复性好，符合检测要求。

加标浓度（mg/kg） 平均回收 率（%） 精密度 RSD（%）

1.0 83.2 6.8

5.0 89.6 5.6

10.0 90.3 4.7

30.0 91.6 3.6 50.0

102.4 3.4

2、液相色谱法

该方法是在GB/T 23377-2009《食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱 法》标准方法上进行改进：用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱 脂、去蛋白处理后，用高效液相色谱紫外检测器测定，与标准系列比较定 量。

2.1 实验部分

2.1.1 仪器与主要试剂

液相色谱仪：LC-1260（二级管阵列检测器 DAD），美国安捷伦公司。

脱氢乙酸标准品：纯度≥99.6%，购自美国。

甲醇：色谱纯。

乙酸铵溶液（0.02mol/L）：分析纯，称取1.54g 乙酸铵用氨水（1+1） 调节pH 至9.0，加水至1000mL 溶液，经0.45μ m 滤膜过滤。

2.1.2 色谱条件

色谱柱：ECOSIL-C18 柱 （5μ m，250mm×4.6mm）；

流动相：甲醇+0.02mol/L 乙酸铵（5+95，v/v）

流速：1.0mL/min

柱温：40℃

检测波长：293nm

应用上述色谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样：

2.1.3 样品处理

称取 5～10g 试样（准确至 0.0001g），加 50mL 水，用氢氧化钠溶液 （8g/L）调节 pH 至 7.2，加入 5mL 乙酸锌溶液（220g/L），5mL 亚铁氰化 钾溶液（106g/L），超声提取 40min，定容至 100mL，静置 30min 过 0.45 μ m 滤膜，供液相色谱测定。

2.2 方法讨论

2.2.1 色谱条件选择

在GB/T 23377-2009 国标方法中，流动项的选择为甲醇+0.02mol/L 乙 酸铵（10+90，v/v）。在实际样品的检测中，考虑到食品中其他添加剂对 于脱氢乙酸检测（如山梨酸、糖精钠等）的影响，能过对不同比例流动相 的实验，发现流动相比例为甲醇+0.02mol/L 乙酸铵（5+95，v/v）优于国标方法条件。

2.2.2 线性关系

在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在 0.5～100μ g/mL 范围内与 响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数 r=0.99999。脱氢乙酸的最低 检出浓度为0.1μ g/mL。

2.2.3 准确度与精密度

参照 1.2.3，选用同一辣椒酱样品，按本方法测定，做加标实验，每 一浓度重复测定6 次，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意， 相对标准偏差范围小于10%，重复性好，符合检测要求。

3、气相色谱质谱联用法

目前尚无气相色谱质谱联用测定食品中脱氢乙酸的国标方法，根据本实验室进行实验建立的方法：试样经乙醚提取，用气相色谱进行分离，特征离子峰进行定性定量。

3.1 实验部分

3.1.1 仪器与主要试剂

气质联用仪：GCMS-7890A-5975C，美国安捷伦公司。

脱氢乙酸标准品：纯度≥99.6%，购自美国。

正已烷：分析纯。

乙醚：色谱纯，重蒸。

脱氢乙酸标准工作溶液：准确称取脱氢乙酸标准品50mg，以乙醚溶解 定容于50mL容量瓶中，再以乙醚分别稀释至1μ g/mL、10μ g/mL、40μ g/mL、 80μ g/mL 120μ g/mL、160μ g/mL 200μ g/mL，配制标准工作溶液。

3.1.2 色谱条件

载气：高纯氦气（99.999%）；

色谱柱：DB-5MS 毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μ m）；

柱流速：1.0 mL/min；

汽化室温度：250℃、柱温程序：初始温度 150℃，保持 0.5min，以 10℃/min 速率升温至180℃，保持6min。

3.1.3 质谱条件

传输线温度：220℃；离子源温度：200℃；离子化方式：EI；电子能 量：70eV；延迟时间 2.0 min；

检测方式：全扫描，质量范围：m/z 25～ 300。

应用上述质谱条件，脱氢乙酸标准品溶液进样，

质谱图如下：

3.2.1 样品处理 称取5～10g 试样（准确至0.0001g），加35mL 水、2mL 氢氧化钠溶液 （20g/L），超声提取20 min，用水定容至50mL，加10mL 正己烷提取一次， 弃去正己烷层，再加1mL 盐酸（1+1）酸化，准确加入10mL 乙醚振摇5min， 静置10min，取上清液供质谱测定。

3.2 方法讨论

3.2.1 质谱条件的选择 根据脱氢乙酸在气相色谱上的良好响应情况，用质谱测定时，仍选用 的弱极性柱 DB-5MS 柱。检测方式选择全扫描、选择离子扫描皆可，本文选择了全扫描。

3.2.2 线性关系

在本实验条件下，脱氢乙酸标准工作液在 0.5～100μ g/mL 范围内与 响应值峰面积有良好的线性关系，相关系数 r=0.99997。脱氢乙酸的最低 检出浓度为0.2μ g/mL。

3.2.3 准确度与精密度 选用同一辣椒酱样品，按本方法测定，做加标实验，每一浓度重复测 定6 次，结果见下表。实验结果显示，本方法回收率满意，相对标准偏差 范围小于10%，重复性好，符合检测要求。

4、结论探讨的三种方法，分离度好，回收率较好，都是食品中脱氢乙酸 含量的良好检测方法。相比较而言，气相色谱法与干扰物质的分离度好， 但样品前处理较复杂；液相色谱法样品前处理简便，特征峰定性较差；气 相色谱质谱联用法样品前处理较气相色谱法简便，定性较色谱更精准。 引用文件： GB/T 5009.121-2003《食品中脱氢乙酸的测定》； GB/T 23377-2009《食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱法》。

目前，有机锡的衍生反应方式有三种：一种是利用硼氢化钠进行氢化反应，这种形式现在较少有人采用；一种是利用格氏试剂（RMgX，R为烷基，Mg为镁，X为卤素）进行衍生反应，这种方式在衍生反应的过程中会产生有害气体，必须在通风柜中进行，且衍生反应完成后还要将多余的衍生试剂分解掉后才能进行有机相萃取。极为不便。另一种即是利用四乙基硼酸钠。这种方式在加入衍生试剂后可以直接进行萃取，不须分解过量的衍生试剂，衍生反应与有机相萃取可以同时进行。大大简化了反应过程。我们选用这种衍生反应方式进行衍生反应。

试剂与仪器

2.1 试剂

2.1.1 去离子水

2.1.2 氢氧化钠(优级纯，山海工学团实验二厂)

2.1.3 氢氧化钠溶液(0.1mol/1)

2.1.4 正已烷(分析纯，广州化学试剂二厂)

2.1.5 冰醋酸(分析纯，广州东红化工厂)

2.1.6 四氢呋喃(分析纯，广州化学试剂二厂)

2.1.7 盐酸-L-组氨酸盐（生化试剂，上海化学试剂公司）

2.1.8 氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）

2.1.9 磷酸二氢钠（分析纯，广州化学试剂厂）

2.1.10 乙酸钠（分析纯，广州化学试剂厂）

2.1.11 四乙基硼酸钠(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司)

2.1.12 新鲜制备萃取溶液

在1升去离子水中溶解0.5g盐酸-L-组氨酸,5g氯化钠和2.2g磷酸二氢钠.用0.1mol/1的NaOH溶液调PH值到5.5。

2.1.13 醋酸盐缓冲溶液

在1升的容量瓶中,溶解约82g的乙酸钠于500ml的水中,用冰醋酸调PH值到期4.5,然后用去离子水定容,摇匀，备用。

2.1.14 衍生化试剂

5%的四乙基硼酸钠四氢呋喃溶液。

2.1.15无水硫酸钠(分析纯，广州化学试剂二厂)

将无水硫酸钠在300℃下干燥4小时，将干燥过的无水硫酸钠盛入广品瓶中，放入干燥器中冷却至室温，备用。

2.2 标准品

2.2.1 三丁基锡(TBT)，10µg/ml(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司)。

2.2.2 二丁基锡(DBT)，10µg/ml(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司)。

2.2.3 二庚基锡(DHT)，10µg/ml(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司，做DBT的内标)。

2.2.4 三丙基锡(TPT)，10µg/ml(德国 Dr.Ehrenstorfer 公司，做TBT的内标)。

2.3 仪器

Clarus 500GC/MS高性能气相色谱/质谱联用仪，带TurboMass工作站 (PerkinElmer公司生产)。

3．测试过程

3.1 样品的前处理

3.1.1 将样品剪成5×5mm的大小

3.1.2 称取约2g的测试样品,放入250ml的锥形中

3.1.3 加入100ml的新鲜制备萃取溶液于样品中,然后在38-40℃振摇30分钟

3.1.4 冷却锥形瓶至室温

3.1.5 移取25ml样品溶液于50ml具塞试管中,加入250μl的醋酸盐缓冲溶液,振刻,测其PH值,如有必要用组氨酸或NaOH溶液调PH值到4.5

3.1.6 取100μl的中间内标物加入到样品溶液中,混合摇匀

3.2 衍生化和提取

3.2.1 加入100μl衍生试剂和5ml已烷于样品中,盖上塞子,振摇片刻

3.2.2 打开塞子放气,然后在振荡器中振摇20mim,频率:200rpm/mim

3.2.3 分离有机相与水相,再加入约2g的无水硫酸钠于有机相中干燥10min

3.2.4 把已烷层倒入样品瓶中,然后用GC/MS分析

3.3 配制校正标准溶液

3.3.1取50μl和100μl浓度为1mg/1的中间标准溶液,20μl浓度为10mg/1的中间标准溶液于有25ml萃取剂的50ml的具塞试管里,加入250μl醋酸缓冲液,调PH值到4.5,校正标准溶液的浓度为10ppb,20ppb,40ppb

3.3.2取100μl浓度为1mg/1的中间内标标准溶液加入到所有的校正溶液中,这样在最后的萃取剂中内标物的浓度就是20ppb

3.3.3 加入5ml正已烷和100μl的衍生试剂,加塞,振摇片刻,放气

3.3.4在振荡器中充分振摇20mim,频率:200rpm/mim

3.3.5分离有机相和水相,在有机相中加入2g的无水硫酸钠干燥10min

3.3.6把已烷层倒入样品瓶中,用GC/MS分析

从细胞里提取出完整RNA并进行纯化，是进行许多基础分子生物学实验研究RNA功能机制方面的研究的首选和关键步骤。包括cDNA文库构建， northern杂交 ,检测细胞的转录水平, 定量PCR ,RT-PCR及体外翻译等。本文将会介绍RNA提取实验步骤，供大家参考。

1.方法背景

  从组织或者细胞中提取总RNA的方法是用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，异硫氰酸狐是一种常见且有效的蛋白质变性剂，在裂解细胞的同时能有效抑制内源性RNA酶活性。同时加入氯仿产生了第二相（有机相），DNA和蛋白质在有机相中被抽提，低pH值的酚将使RNA留在上层水相中。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩, 随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，最终获得总RNA。

1.细胞或者组织样品匀浆处理

(1)贴壁培养细胞：细胞量为107,无须用胰蛋白酶消化，在去除培养液后，用预冷无菌PBS洗细胞一次，去上清，再加入1mL单相裂解液裂解细胞，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(2)悬浮培养细胞：细胞量为107,可直接转移到15 mL离心管，500 rpm离心5 min 后；用预冷无菌PBS洗涤1次，弃上清，再加入1mL单相裂解液悬浮细胞沉淀，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(3)组织样品：解剖所要的组织后，先将这些组织切成小块（100 mg),然后将组织放入盛有液氮的研钵中，用研棒磨碎组织，使组织成粉末状。在研磨过程中要不断添加液氮使组织保持冷冻状态，最后加入1mL单相裂解液裂解组织细胞，再转移到1.5 mL离心管。

2.RNA提取

(1)样品加入单相裂解液后，室温放置5 min,使样品充分裂解。如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

(2)如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等，12000 rpm离心5 min,取上清。

(3)按每1mL单相裂解液加入200 μL氯仿，振荡混匀后室温放置15 min,使其自然分相。禁用旋涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

(4)4 ℃ 12 000 rpm离心15 min后，样品会分成三层，黄色的有机层，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。

(5)小心吸取上层水相，至另一个新的1.5 mL离心管中。不要吸取中间界面，以免DNA和蛋白污染。

(6)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，-20 ℃放置1h以增加RNA沉淀。

(7)4℃ 12 000 rpm 离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

(8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇（用DEPC水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀。

(9)4℃ 8 000 rpm离心5 min,尽量弃上清。用移液器小心吸弃上清，注意不要吸走RNA沉淀。

(10)室温晾干5〜10 min,让最后残存的痕量乙醇挥发。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

(11)用50 μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀，RNA溶液要放在-70℃保存。纯水和TE均需DEPC处理并经高压消毒。

3.RNA定量

RNA提取 完就应该来做RNA定量，RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260 nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40 μg/mL的单链RNA。如用1cm光径，用ddH20稀释DNA样品n倍并以ddH20为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

RNA (mg/mL) =40x (OD260读数）x稀释倍数(n)/1000 

纯RNA的OD260/OD280的比值为1.8-2.0,根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值比1.8低，说明有残余蛋白质、酚或者其他杂质存在；比值比2.0高，则提示RNA有降解。

4.RNA凝胶电泳

  RNA的电泳目的是检测28S和18S条带的完整性和它们的比值，或者是mRNA Smear 的完整性，可以用普通的琼脂糖胶进行。如果28S和18S条带明亮、清晰，没有出现涂抹状片段，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则可判断认为RNA提取的质量是好的。

5.保温实验

保温实验主要是来检测RNA酶的存在，关于RNA检测以及RNA酶的检测可以参考另外一篇 《如何检测RNA》

6.材料与试剂

6.1.试剂

单相裂解液（4 mol/L的异硫氰酸胍，0.1 mol/L的乙酸钠，0.2% β-巯基乙醇，50%饱和酚），氯仿（分析纯），异丙醇（分析纯），75%乙醇（用0.1%的DEPC处理过的无RNA酶的水稀释），DEPC·H2O,TE溶液（10 mmol/L的Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L的EDTA），PBS（1×），焦碳酸二乙酯（DEPC），液氮。

6.2.仪器设备

冷冻台式离心机，电泳仪，电泳槽，电热恒温水槽，紫外分光光度计。

相关阅读：

《提取高质量RNA的技巧》

《植物组织RNA提取》

红色溶液我并不知道是什么，因为你的试剂来源不明，说不定混有别的东西。

可以猜测是苯酚氧化之后形成的苯醌。

原因是97.5%纯度的乙醇是用苯作共沸物制备的，时间长了往往会有微量苯酚形成，强碱作用下变色很快。

还有可能就是本来就有少量酚酞之类的东西。

白色固体有氢氧化钠，可能有乙醇钠，不溶于水说明试剂有别的杂质，也有可能是碳酸钠在碱浓度较高时不溶。

凝胶的话，由于红色液体中有碱，发生水解形成乙酸钠，乙酸钠在饱和氢氧化钠溶液中沉淀析出了。

我只能提出猜想，希望你自己再设计方法检验了。

醋酸钠CH3CH2COONa，可以用中和反应来进行，

你可以借助醋酸含量90%以上（食用醋乙酸的含量太低10%不到），醋酸CH3CH2COOH与氢氧化钠NaOH酸碱中和生成醋酸钠CH3CH2COONa，与水H2O。

你的那个想法很有意思，你可以由盐酸与醋酸钠反应制成食盐与醋酸，反过来则是行不通的，你说氢气与氧气反应生成水，要是水能反应生成氢气与氧气就好了，呵呵

你如果需要这个产品。你可去一些化工商店问问，一般都有的。