叶绿素含量测定

用90%乙醇即可。波长分别为750nm、663nm、645nm、630nm，国内方法公式和国外方法公式不同。国内参考公式为（11.64*（D663-D750）-2.16*（D645-D750）+0.10*（D630-D750））*V1/V*比色皿光程。

辣椒植株叶绿素含量的测定方法，取材，测定如下：

材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。

（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

步骤

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

叶绿素含量的测定方法如下：

叶绿素含量跟光合作用速率、植物营养状况等指标密切相关，通常，我们会通过对叶绿素含量的测定，来了解植物的生长状况。一般，植物叶绿素含量测定有三种：分光光度法，活体叶绿素仪法和光声光谱法。其中分光光度法是应用最广泛的叶绿素含量测定方法。

叶绿素含量的计算：

叶绿素含量测定首先得提取叶绿体色素，叶绿体 色素中含有叶绿体a，叶绿体b，胡萝卜素和叶黄素。在提取叶绿体色素时，我们使用不同的试剂，如丙酮，乙醇等有机物。

当试剂不同时，所得到的结果也会不 同。上图中我们使用四种不同的溶剂，进行叶绿体色素的提取。图中通过对四种溶剂在600nm-700nm波长间的吸光量进行比较，从而计算叶绿素含量，而 从图中，我们可以大致得到，这四种叶绿素提取液的光吸收性质基本相同。

利用分光光度法测定叶绿素含量是依据Lambert-Beer定律，数学表达式为A=Kbc。其中，A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。

叶绿素a,b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别在663nm和645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.67和45.60。根据Lambert-Beer定律，我们可以列出方程：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb

D645 = 16.67Ca+45.60Cb

根据以上方程组，可以求得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645

Cb = 22.88D645 – 4.67D663

然后我们又可求得叶绿素总量CT =（D652 × 1000）/ 34.5

95% 丙酮2乙醇(匀浆)的提取效果最佳，因此，我们在进行叶绿素含量测定的时候，可以考虑运用95% 丙酮2乙醇(匀浆)作为提取液。

目前已经发明了比较方便的用于测量叶绿素含量的仪器—叶绿素含量测定仪，它是通过测量植物的叶绿素相对含量来了解土壤的性能指标和植物的硝基需求量，并了解植物的生长状况。

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜，叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等，叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。

1、环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染。

2、元素缺乏也可影响到测量叶绿素的含量。

3、实验样品的光照环境也会影响到测量结果。

光合作用的实质是叶绿素吸收光能用来氧化水，放出分子氧，并将二氧化碳还原为碳水化合物，成为果树主要有机营养的来源。这个反应必须借助叶绿素。叶绿素的主要成分为叶绿素a和叶绿素b，均为卟啉化合物，它不溶于水而只溶于乙醇、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂。叶绿素a、叶绿素b的溶液都有两个吸收峰，一个在蓝紫区，一个在红光区。在蓝紫区的高峰是所有卟啉化合物所共有的，只有在红光区的吸收峰是叶绿素所特有的，我们利用这个特点进行叶绿素的测定。

方法原理：用丙酮提取叶绿素，在特定波长下测定其吸收度，然后用公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。