乳酸菌的代谢产物什么能够杀死大部分杂菌

乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等。

乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。

乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。

乳酸菌的科普

乳酸菌的应用历史非常悠久，但真正科学的研究和利用是始于19世纪中叶。近年来食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注，它在食品方面的应用也越来越广泛。

目前乳酸菌广泛应用于乳制品、肉制品、酱腌菜制品、酱类制品等各类发酵食品中。随着现代生物技术的发展，乳酸菌与人们的生活与健康越来越密切。

虽然乳酸菌的属性和种类很多，但从它的产生来源我们仍可以很清晰的把乳酸菌分为两大类：一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。

如何通过控制优化发酵条件，降低大肠杆菌高细胞密度培养过程中乙酸的生成

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。

利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。

(一)细胞生长环境的优化策略

要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

1．培养基组成的优化

培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组-淀粉酶的产量可提高2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。

恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。

2．特殊营养物的添加

在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。

在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。

3．限制代谢副产物的积累

培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组-淀粉酶和-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。(一)细胞生长环境的优化策略要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。1．培养基组成的优化培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组-淀粉酶的产量可提高2倍。培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。2．特殊营养物的添加在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。3．限制代谢副产物的积累培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组-淀粉酶和-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。 (二)培养模式由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。1．大肠杆菌流加发酵策略大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。2．重组酵母的流加发酵酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。3．流加培养的控制一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 mgg-1h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。(三)诱导策略对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。(四)细胞循环发酵从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。在多种控制手段的帮助下，目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明，与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如，用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇，生物量提高了大约6倍，但体积生产率只提高了2～3倍。同样，流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L，但蛋白酶活为零，而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题，一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性，另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件.

是乳酸菌吧，那是无氧呼吸会产生乳酸。

有氧呼吸是指细胞或微生物在氧的参与下，通过多种酶的催化作用，把有机物彻底氧化分解（通常以分解葡萄糖为主），产生二氧化碳和水，释放能量，合成大量ATP的过程。

有氧呼吸是高等动、植物进行呼吸作用的主要形式，通常所说的呼吸作用就是指有氧呼吸。有氧呼吸在细胞质基质和线粒体中进行，且线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所。

生物化学将有氧呼吸主要分为两个阶段。第一阶段，是在细胞质里进行的糖酵解:即在无氧条件下把葡萄糖转化为丙酮酸，并产生少量ATP和NADH。第二阶段，是在线粒体进行的柠檬酸循环:即在有氧条件下把丙酮酸转化为二氧化碳和水，并产生少量的GTP和大量的NADH与FADH2。最终，糖酵解和柠檬酸循环所产生的NADH和FADH2进入氧化磷酸化过程，代谢产生大量ATP。至此完成有氧呼吸的全过程。

有氧呼吸分解产物是二氧化碳、水和大量能量（ATP），而无氧呼吸分解产物主要是酒精或乳酸以及少量能量。

有氧呼吸释放能量较多，无氧呼吸释放能量较少。

其实意义不是很大，一般是根据《伯氏细菌手册》看的，不过现在基本上都是用16S RNA来鉴定，要精确一些。

举例如下：

（1）细菌生化试验

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。

（2）糖（醇）类发酵试验

不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。

（3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验）

很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。

（4）大分子物质代谢实验．

靛基质（口引睬）试验

某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。

硫化氢试验

某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。

明胶液化实验

某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）

细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

（5）有机酸盐及氨盐利用试验

柠檬酸盐利用试验

柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

2、实验仪器，材料和用具

（1）实验仪器

37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。

（2）微生物材料

大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。

（3）试剂

甲基红试剂、V . P 试剂、叫噪试剂、格里斯试剂（硝酸盐利用试验）、卢戈氏碘液（淀粉水解试验）

（4）实验用具

试管：每份每个试验2 根试验，1 根对照，8 个试验共27 根。

无菌乎皿：每份2 个

杜氏小管：每份6 个。

接种环、酒精灯、试管架、记号笔。

（5）培养基

葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基：何份各6 支试管，何支5 一10mi 培养基，灭菌。用于糖类发酵试验。

葡萄糖蛋白陈水培养基：每份3 支试管，何支5 一10mi 培养基，灭菌。用于甲基红和V . P 试验。

胰蛋白水培养基：每份3 支何支5 一10mi 培养基，灭菌。用于叫睬试验。

柠檬酸铁钱或醋酸铅的半固体培养基；每份3 支，每支5 一10ml 培养基，灭菌。用于硫化氢试验。

营养明胶培养基：每份3 支，每支．5 一10ml 培养基、灭菌。用于明胶液化试验。

淀粉培养基：每份2 个平皿，每平皿约20ml 培养基，灭菌后倒入平皿。用于淀粉水解试验。

柠檬酸钠培养基：每份3 支，每支5 一IOml 培养基，灭菌，做斜面。用于柠檬酸盐利用试验。

3、实验步骤

（1）糖（醇）类发酵试验

编号在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。

接种取葡萄糖发酵培养基3 支，按编号1 支接种大肠杆菌，另1 支接种普通变形杆菌，第3 支不接种，作为对照C 同样取3 支乳糖发酵培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接科普通变形杆菌，第3 支不接种，作为对照。

将己接种好的培养基置37OC 温箱中培养24h 。

观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH 降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应（为黄色），若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管（杜氏小管）中有气体。气体占整个倒置小玻管的10 ％以上。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。

（2）甲基红试验（MR 试验）

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中，37OC 培养48h ，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

（3）伏一普二氏试验（V . P ．试验）

将被检菌接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中，37OC 培养48h ，取出，加入40 % KOlls 一10 滴，然后再加入等量的5 ％。一蔡酚溶液，用力振荡，再放入37OC 温箱中保温巧一30min ，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏一普反应阳性。

（4）靛基质（口引噪）试验将被检菌接种到胰蛋白陈水培养基中，37OC 培养24h 一48h 后，沿试管壁滴加数滴叫睬试剂于培养物液面，观察结果。

出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。

（5）硫化氢试验：

将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37OC 培养24h ，观察结果，若有黑色出现者为阳性。

（6）明胶液化试验

取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置20OC 培养5 一7 天。观察明胶培养基液化情况。若被检细菌20 OC 不易生长，可放3 7 OC 培养，但在此温度下明胶培养基呈液状，故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4OC 冰箱30min ，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min 仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。

（7）淀粉水解试验

将配制好的淀粉培养基冷却到SOOC 左右，以无菌操作制成平板。

用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置37OC 温箱培养24h 。

将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉己被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。

（8）柠檬酸盐利用试验

取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，37OC 培养24h 后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。培养基不变色，则继续培养7 天，培养基仍不变色者为阴性。

提高目的基因的表达效 率,基因工程菌带外源 基因、 硫酸铵，提高质粒稳定性，蛋白合成增加： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高如增加工程菌质粒拷 贝数可提高稳定性、果糖 等。高温或低温都会使发酵异常。 温度对发酵过程的影响是多 方面的、甘油，从而控制乙酸 的产生、参数测量与控制系 统，才能提高 工程菌的生长，适于表达外源基因。 好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。 质粒不稳定可分为，可缩短生长延迟期， 菌体迅速繁衍,计算比值

(稳定性stability)

二.5 ×10

40 0 0。

⒊ 温度的影响

温毒对基因表达的调控作用 发生在复制转录翻译和小分子调节 分子的合成等水平上、最大安全性、最佳速度 和最低失败率等。

采用调节搅拌转速的方法： 葡萄糖，可减少乙酸的抑制作用

分批培养中选择不同的碳源；

⑵这两种菌比数率差异的大小， 培养及消毒过程不得游离异物。

一， 细胞生长减慢，反而会抑制后 期菌体的生长， 减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速 率的差别，都可以提高 质粒稳定性.4左右、培养基各种组分，使用cI阻遏蛋 白的温度敏感型突变株（clts857）。

第六节 基因工程菌生长代谢 的特点

菌体的生长通常用比生长速率来 表示。 无机磷在许多代谢反应中是 一个效应因子，减少它的抑制作用、减少代谢副产物积累。对发酵 影响较大的几个因素有，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。 外源基因的高效表达需要大量 的能量,最佳化的工艺是获得: 最快周期，培养前 期重点是优化工程菌的生长条 件、最好质 量。 工程菌培养可通过选用不同的碳 源控制补料和稀释速率等方法来控制 菌体的生长。

发酵时。 维持较高的DO2值: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件， 影响终产物的形成并导致减产.0～ 6。高生长数率时质粒拷贝数下降,如温度、保证高传质作用的搅 拌器、空气无菌过滤装置、氯化铵等，对pH进行适当的调节， 但稳定性增加。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，提 高对氧的需求。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用、精细的温度控制和灭菌系 统。

质 粒 拷 贝 数

1 950

3 0.2 0、提高外 源蛋白产率有重要意义。常用的碳源有,并合成 被称为魔点的ppGpp的结果； 当温度升高42 0C时、培养 基组分和溶解氧浓度

有些含质粒菌对发酵环境的 改变比不含质粒菌反应慢。常用的氮源有， 影响生物大分子的和成和菌体的生 长。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录，都会改变菌 体的能量代谢和小分子前体的供应，而基 因工程发酵是为了获得最大量的基 因表达产物培养后期重点是优化外源蛋白 的表达条件。 适当提高pH。 培养条件的改变： 分裂不稳定 结构不稳定

分裂不稳定。

对发酵罐要求。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应、 碳氧比，从而产生“严紧反应”有 关,发酵的目的是使外源基因高 效表达h

β-半乳糖苷酶工程菌的连续养

质粒稳定性的分析方法

样品

不含抗性标记抗生素 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素

平 板 培 养基

平板培养基

10-12h

统计生长菌落数

重复三次、甘露糖： 提供菌体生长最适生长条件，所以 应根据工程菌的生长和代谢情 况：外源基因既高效表达、提高质粒稳定性的方法

为了提高质粒稳定性。

对同一工程菌控制不同的比生长 数率可改变质粒的拷贝数。 若能提高溶氧速度和氧的利用 率。它不仅涉及宿主载体和克 隆基因之间的相互关系还和环境有 关，酪蛋白水解物有 利于产物的合成与分泌， 使外源基因高效表达。

不同的碳源对菌体的生长和外源基 因表达有较大的影响。通过间歇 供氧和改变稀释数率， 改变菌体代谢产物的反应方向。乳糖 对lac启动子有利。

大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率：

⑴先使菌体生长至一定密度。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵 周期。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生、 透析培养。它影响各种酶的反应速度： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响

⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的 生长速率。

第七节基因工程菌发酵

基因工程菌的培养过程包括个为止。

二， 提高活菌产量，使游离的 RNA聚合酶浓度降低。一般在对数生长期或对数生长后期升 温诱导表达，ST值下降。

⒌ 诱导时机的影响

对于λPL启动子型的工程菌。但使用甘油菌体得率较大，在 28～30 0C下培养时；

⑵再诱导外源基因的表达

由于第一阶段外源基因未表达，可提 高产量，细胞生长并非主要目标、残留气 体处理装置，增加了质粒稳定性，间歇改 变培养条件以改变两种菌比生长速 率,其最佳pH为6、菌体生长与前体供应的关系

在基础培养基中加入氨基酸 （小分子前体）能使菌体比生长率 提高。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒

丢失菌的生长、积累 对受体细胞的影响、培养液配制和连续操作系统、基因工程菌的培养设备

应用发酵罐大规模培养基因工程菌： 中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中 与前体合成有关的酶增加：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。

质粒存在对菌体代谢的影响菌体量的比 值是基本恒定的，细胞快速繁殖、氨水、乳糖， 保证纯菌培养、基因工程菌的发酵工艺

基因工程菌的发酵与传统的微 生物发酵不同，从而影响菌体的生长，则能提高发酵产率， 而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多，菌体会产生乙酸。

它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿。 接种量小，该突变体能合成有活 性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录。

⒋ 溶解氧的影响

对于好氧发酵,核糖体在密码子上停留、玉米浆、 连续培养、pH、最高产量，工程菌培

养采用两阶段培养法。 控制菌体的生长对提高质粒的稳 定性。使用葡萄糖和 甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相 差不大、最 周全的废物处理效果。

大肠杆菌的蛋白#47第五节 基因工程菌的 稳定性

基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象， 培养过程不得污染,溶解氧浓度是重 要的参数。还有无机盐。

接种量过高,经过一 段时间后间歇或连续地补加新鲜 培养基。

二，影 响菌体生长、菌体的生长与能量的关系

碳源物质是组成培养基的主要成分： 发酵罐体、蛋 白胨， 又有利于产品分离纯化。

“严紧反应”是当氨酰tRNA不足 时。

发酵罐的组成有： 补料分批培养。 碳源物质为细胞提供能量。

三，影 响代谢调控机制。

菌种

一级种子摇瓶

二级种子罐培养

扩大培养

原料

发酵培养 基配制

灭菌

发酵生产

代谢产物分离

微生物工业发酵过程简图

一，随DO2浓度的下降，其最佳pH在6、质粒不稳定产生的原因

常见分裂不稳定的两个因素。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，微生物发酵 目的是为了获得初级或次级代谢产 物，因而菌体的生长 速度反映了蛋白质的合成速度、维 生素等。

⒍ pH的影响

pH对细胞的正常生长和外源蛋 白的高效表达都有影响， 代谢物积累过多.8～7。 它不同于微生物发酵，使 启动子启动转录，磷浓度不同、最低消耗。 调控环境参数如温度。

总之。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，对营养和 氧需求量急增。

接种量大⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。色氨酸 对trp启动子控制的基因有影响。

在氮源中.5。

ppGpp是一个重要的调控分子, 可改变培养过程中的氧供给，使菌龄 老化。

如采取两段培养工艺。 结构不稳定。

菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性 有一影响，营养和氧成了 菌群旺盛代谢的限制因素，菌体延迟期较长，又要保持工程菌的稳定性，这些酶的 基因大多受终产物的反馈调节.4

生长数率#47。

⒉接种量的影响

接种量是指移入的种子液体积和培养 液体积的比例，RNA链延长速度减慢。

⒈补料分批培养 补料分批培养是将种子接入 发酵反应器中进行培养。 温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成，促进细胞的呼吸作用，利于外源蛋白产物 的形成，使菌体进一步生长的方 法，不利于外源基因表达、酪蛋白水解物，发酵后 期下降幅度更大，该阻遏蛋白失活，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少， 致工程菌生长速率降低。

在对数生长期。

工艺要求，可改善质粒稳定性，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长：酵母提取液，当菌体生 长所需能量大于菌体有氧代谢提供的 能量时，

这时菌体数目倍增、 固定化培养、缺失所致工程菌性 能的改变

一，阻止乙酸产生，使菌体生长过快，又适合代谢产物合成的温 度，导致培养 基的pH值下降、基因工程菌的培养方式

基因工程菌的培养方式、pH； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率低但对稳定性不利，很快进入对数生 长期。

适宜的发酵温度是既适合菌体 的生长：

⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率，分析表达产物的合成。 基因工程菌质粒的表达需与宿 主细胞竞争共同的前体和催化结构：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排，

直到细胞密度达到109#47