硫堇染色原理

1简单染色

不同的细菌，或者由于观察者所侧重观察的内容不同一，所以所使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤。最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。

2芽孢染色法

芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的细菌能产生内孢子，这些孢子耐高温、干旱及有毒化学试剂。内孢子还能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。然而，芽孢一旦着色后就很难脱色。

虽然芽孢通常可在革兰氏染色片中看到(芽孢由于不易让染料进入多呈现无色),但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，更便于观察。其实验的操作方法与革兰氏染色类似。主要的芽孢染色法有以下两种。

(一)孔雀绿染色法

(1)将生有芽孢的斜而菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液(约为

7.6%)染10 min。

(2)用自来水冲洗。

(3)用0.5%番红液复染30%.

(4)水洗，吸干。

(5)镜检：芽孢呈绿色，菌体和芽抱囊呈微红色，但应注意菌体中有异染粒时，也可呈绿色。

(二) 石炭酸复红染色法

(1)按常规涂片。

(2)滴加石炭酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸气但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5 min。

(3)涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色至无红色染剂洗脱为止。

(4)彻底水洗。

(5)用吕氏美蓝复染2 min -3 min。

(6)水洗、吸干。

(7)镜检：镜检时，菌体及孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。

具体实验时，在对一些特殊芽孢染色时，需要对染色液和复染液进行修改。

3鞭毛染色

鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，直径一般为10nm~20 nm,超出了光学显微镜的观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到鞭毛。通过使用特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能够在光学显微镜下观察到鞭毛，而且能检测鞭毛在细菌中的分布。尤其是鞭毛染色可用于区分假单胞菌科的一些有两极鞭毛的细菌和肠杆菌科有周身鞭毛的细菌(在运动时)。

鞭毛十分细小，很容易从细菌上脱离，所以要得到非常满意的鞭毛染色玻片十分困难。另外，很多染色方法会产生沉淀物，这又使得观察鞭毛十分困难。

鞭毛染色一般分为两类：一种是银盐法，使银在鞭毛上堆积；另一种是使用复红沉积在鞭毛上。

(一)银盐沉积法(改进的Fontana方法)

应使用绝对干净(无油脂)的载玻片进行染色，最好是新的无油载玻片。用过的载玻片要在酪酸洗液中浸泡，并用蒸馏水冲洗干净后方可再次使用。

细菌在琼脂斜面上，比最佳生长温度低3℃~5℃的温度下培养，可在斜面上加1滴~2滴灭菌的生理盐水保持湿度。

(1)将载玻片在火焰上快速灼烧5s,放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域(用镊子夹住载玻片的一端)。

(2)用移液管或巴斯德移液管移取2mL无菌水加入到幼龄(通常为18 h)、生长活跃的斜面菌株中，慢慢振荡并旋转试管使菌株悬浮。建议尽量避免使用接种环。然后转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动性。用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止。放入20 ℃ -30 ℃培养箱中培养30 min,然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端。倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线。在空气中自然干燥，不要加热玻片。

(3)用媒染色剂媒染5 min。

(4)慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液。

(5)用热的Fontana银液覆盖，染色5 min,每隔1 min更换1次染色液( Fontana银液在沸水浴中加热)。细菌涂层的每一部分都始终要浸在染色液中，不能裸露。

(6)用水冲洗，在空气中晾干，镜检。

(二) Leifson替代染色法

下述Leifson鞭毛染色法可以代替上述方法的(3) ~(6)。

(1)滴加1 ml的Leifson鞭毛染色液，注意不要使染色液干燥，直到玻片上形成细微的铁锈色沉淀(约10 min) 。

(2)慢慢地用蒸馏水充分冲洗干净。

(3)用1%的亚甲基蓝复染5 min ~10 min。

(4)用水洗净，空气中干燥，镜检。没有复染时，细胞和鞭毛都呈现桃红色，复染后，细胞染成蓝色，鞭毛染成红色。

实验中需要注意的是鞭毛很容易脱落，若观察时视野中大多为周身鞭毛细胞，说明该菌是周毛菌，但若观察到一个明显的极端鞭毛细胞时，并不一定说明不是周毛菌。

注意事项：

(1)适宜的培养基、温度和通气条件下，以短期内多次连续接种培养的幼龄菌种鞭毛情况最好。因此，用于鞭毛染色的菌种常常用幼龄菌，菌龄老化或某些培养条件变化常导致鞭毛脱落或丧失。

(2)玻片应清洁无油污。鞭毛非常纤细且容易脱落，故操作过程动作要轻。

(3)染色法的染料须当日配制， 4 h内效果最好。所以鞭毛染色液最好现用现配。

4荚膜染色

荚膜是某些细菌在新陈代谢过程中形成的，分泌于细胞壁外的一层胶状黏液性物质，主要化学成分是多糖类物质。荚膜的折光性低，易溶于水，与染料亲和力低，但荚膜的通透性比较好，某些染料可透过荚膜而使菌体着色。因此染色后在菌体周围有一浅色或无色的透明圈，即为荚膜。一般采用负染色的方法，使背景与菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨，故又称衬托法染色。因荚膜薄，且易变形，所以不能用加热法固定。

(一)制片

加1滴6%葡萄糖水溶液于载玻片一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72 h左右的胶质芽孢杆菌与其混合。

(二)推片法制片

加1滴墨汁充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层， 自然干燥。

(三)固定

滴加1滴~2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1 min, 自然干燥；也可以不加处理， 自然干燥。

注意：不能用火加热干燥。

(四)结晶紫染色

在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色。

(五)冲洗

2 min后，以20%硫酸铜冲洗数次。再用自来水冲洗1次。

(六)拭干水分后镜检

用擦镜纸拭干水分后镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。

5死活染色

在显微镜下活细胞细胞膜完整、立体感强，细胞质透明度好，颗粒状物质少；死细胞膜破裂，无立体感，细胞通透性差，有颗粒状物质、空泡。

染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，简便，易于操作，实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。原理：因为活细胞的细胞膜具有选择透过性，细胞不需要的物质通常不进入细胞，染色剂中如台盼蓝能进入死细胞，从而可以使死细胞染色。依此染色便可以判断细胞的活性。

活细胞必须要通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞染料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双乙酸酯等。台盼蓝染料正常情况下被活细胞拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不被台盼蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜观察很容易识别出死亡的染色细胞，并可用细胞计数板进行计数。

用美蓝染色液可以对酵母菌细胞进行死活染色鉴别。美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母因为新陈代谢不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，而细胞不染色。因此，用美蓝对酵母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，蓝色的为死细胞。需要注意的是：一个活细胞的还原能力是有限的，必须严格控制染色的时间和染料的浓度。

方法：取0.1%美蓝液一滴，滴在玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混匀。染色3 min ~5 min后，加盖片制成水浸标本片，即可镜检，这种方法也适用于细菌和霉菌。答案来自

瑞特（Wright）染色法。酸性染料：伊红；碱性染料：亚甲蓝。 甲醇：染料溶剂。

（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合後，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。

（2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色後，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒是碱性蛋白质，和酸性染料伊红结果，染粉红色，称之为嗜酸性物质；细胞核蛋白与淋巴细胞 胞浆是酸性，和碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称之为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态和伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称之为中性物质。

（3）PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B後才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAM GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。

rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀後以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm 天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2，随著美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞著色不良。

血涂片

瑞氏染色法原理

1. 瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。

美蓝(又名亚甲蓝mehyleneblue)为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构,通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为一,二,三甲基硫堇等次级染料(即天青)市售美蓝中部份已被氧化为天青.伊红(又名曙红cosin)通常为钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀,即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后,又重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。2.细胞的染色既有物理的吸附作用又有化学的亲和作用.各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染色料的亲和力也不一样.因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩,例如血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白质与酸性染料伊红结合染粉红色称为酸性物质,细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色称为嗜碱性物质,中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色称中性物质.

血涂片

实验材料

3.1实验材料：医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、消毒牙签

3.2实验试剂：瑞氏染液、抗B血清、抗A血清、生理盐水、蒸馏水

3.3仪器设备：Motic光学显微镜

实验步骤

4.1ABO血型鉴定

4.1.1取一块清洁玻片，用记号笔标上记号。

4.1.2用小滴管吸A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸B型标准血清（抗A）一滴加入右侧

4.1.3以穿刺法自左手无名指指尖取血，在玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。

4.1.4静置室温下10—15min后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。

4.2血涂片的制作及血细胞观察

4.2.1取末捎血一滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后便推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜

4.2.2血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.

4.2.3用蜡笔在血膜两侧划线,以防染液溢出,然后将血膜平放在染色架上.加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定0.5-1.0分钟.滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水,与染料混匀染色5-10分钟.

4.2.4用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。

4.2.5白细胞分类计数。

选择涂片的体尾交界处染色良好的区域,在油镜下计数100个红细胞,按其形态特征进行分类计数,求出各类细胞所占比值。

瑞氏染液:瑞氏染料1g加甲醇(AR)600ML。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中,加少量甲醇,充分研磨使染料溶解.将已完全溶解的部分倒入棕色试剂瓶中,未溶解部分再加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解于甲醇为止。新配制的染料偏碱,须在室温和37℃下一定时间待染料成熟,主要美蓝逐渐增多为天青B后才能使用.贮存时间越久染色效果越好,因此,Deamgilliland等采用吸光度比值(rA)作为瑞氏染料的质量规格.rA测定方法如下:取瑞氏染液15-25ul(视染液浓度而定)加甲醇10ml稀释,混匀后以甲醇为空白管分别以波长650nm,525nm比色,rA=A650/A525。

因为美蓝吸收峰为波长650nm,伊红吸收峰波长为525nm,天青B吸收峰也为650nm,但吸光度A约为美蓝的一半.所以新配制染料的RA接近2,随着美蓝逐渐氧化为天青B,RA也相应下降,RA下降达1.3±0.1即可使用.瑞氏染料在贮存过程中必须塞严,以防甲醇挥发和氧化为甲酸.有人主张配方中加入30ml甘油,防止甲酸挥发,并可使细胞染色清晰.甲醇必须纯净,如甲醇中丙酮含量过多,染色偏酸,使细胞着色不良。磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾0.3g加磷酸氢二钠0.2g再加蒸馏水至1000ml,配制成磷酸盐缓冲液调整PH,如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。

正常参考值

细胞类别成人

杆状核0.01-0.05

分叶核0.50-0.70

嗜酸性粒细胞0.005-0.05

嗜碱性粒细胞0-0.01

淋巴细胞0.20-0.40

单核细胞0.03-0.08

附注

1要避免重复计数,玻片应由血膜边缘向中央依次上下呈曲线移动.

2白细胞总数超过20×109/L,应分类计数200个细胞,白细胞数明显减少的血片,可检查多张血片。

注意事项

1) 玻片的清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24小时,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20分钟,再用热水将肥皂和血膜洗去,用自来水反复冲洗,必要时再置95%乙醇中浸泡1小时,然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。

2) 细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。

3) 一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。

4) 血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥.

5) 染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件.

6) 染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.

7) 冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.

8) 染色过深可用甲醇或酒精适当脱色,最好不复染,必须复染时,可将染液先稀释好再复染.

9) 染色时应注意保护血膜尾部细胞,不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现.

染色结果

在正常情况下血膜外观为粉红色，在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，染色质清楚，粗细松紧可辨。染色结果偏酸，则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱，则所有细胞染成灰蓝色，颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗，偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色.

嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

原文连接如下

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一般性操作技术血涂片制备；细胞染色；显微检查；血液病诊断；染色不良；瑞特（Wright）染色法；酸性染料；伊红；碱性染料；亚甲蓝；吸附作用；PH对细胞染色的影响；甲醇；吉姆（Giemsa）染色法春天要常用润肤剂，它含有松香油脂酸和丰富维生素a，常用可加快皮肤血液循环，剌激面部细胞分泌，有效改善皮肤生理环境，减少气候对皮肤的危害。

第二节 血涂片的制备和细胞染色

血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。

但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要革本技术之一。

血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。

1．瑞特（Wright）染色法 ：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。

（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。

（2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

（3）PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAM GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm 天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。

2．吉姆萨（Giemsa）染色法 ：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。

第二节 血涂片的制备和细胞染色

血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。

但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要革本技术之一。

血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。

1．瑞特（Wright)染色法 ：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。

（1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。

（2)细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。医学全在线

（3)PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAM GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定)，加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm 天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。

2．吉姆萨（Giemsa)染色法 ：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。