乙酸乙酯能在水溶液中萃取tritonx-114，使蛋白留在水溶液中么

Triton X-100是一种非离子型去垢剂

分子式：C14H22O(C2H4O)n

用途：Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂）,常作为添加剂使蛋白保持稳定,尤其是膜蛋白.

性质：

Triton X-100对细菌等微生物没有杀伤作用.

2.Triton X-100在紫外波段下有光吸收（lambda max = 275 nm and 283 nm in methanol）,因此,当缓冲液中存在Triton X-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量.

3.Triton X-100常与CHAPS等zwitterionic 去垢剂一起使用来纯化膜蛋白,使膜蛋白保持其天然构象.

4.Triton X-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性,因此在Immunostaining时常使用含 0.1%-0.5%Triton X-100的PBS或TBS.

5.Triton X-100非常稳定,密封避光 +2 to +8℃条件下可以长期保存.

6.Triton X-100是透明,略显粘稠,稍微发黄的液体.

7.Triton X-100的密度为1.07 g/ml,pH6.0-8.0（5%的溶液）.

8.Triton X-100可以高压灭菌.

9.用Triton X-100来裂解细胞时,0.1% Triton X-100就足够了,不过,达到0.5%时也没问题.

10.蛋白酶K在含1% Triton X-100的溶液中依然保持活性.

11.可以使用Amberlite hydrophobic XAD resins and Rezorian A161 cartridges 来去除Triton X-100 .

去垢剂(又称表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多.

中性去垢剂又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用.一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200；多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯醇醚,如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌.中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂.

希望能采纳!

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解.提取的温度要视有效成份性质而定.一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间.但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作.为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等）.

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择.

1、pH值

蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH

范围内.用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液.

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用.同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔.升浓度为宜.缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液.

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必须在低温下操作.丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内（度为10%,40度为6.6%）不会引起酶的变性失活.另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料.

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多,主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶；当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀.

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外,一般可在室温中进行.一般温度低蛋白质溶介度降低.但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低,更容易盐析.（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低.（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）.因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%.

蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等.

其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升）,在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性.硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.

蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸）,用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行.此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短.

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用.

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行.

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开.

超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质.

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex

ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）.

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开.

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开.值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质.

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT

FACE="宋体"

LANG="ZH-CN">纤维素）,当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来.（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity

chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高.这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合.其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离（Separation）,提纯（Purification）

和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用.

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等.

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织.

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施.对超声波敏感和核酸应慎用.

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.

5、化学处理法：有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好.

无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取.

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩.常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩.

2、空气流动蒸发浓缩

空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩.

3、冰冻法

生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的.如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液.

4、吸收法

通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩.所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开.常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积.

5、超滤法

超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点.应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同,必须根据工作需要来选用.另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响.Diaflo

超滤膜的分子量截留值：

膜名称分子量截留值孔的大的平均直径

XM－300300,000140

XM－200100,00055

XM－5050,00030

PM－30 30,00022

UM－2020,00018

PM－1010,00015

UM－21,00012

UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动.然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中.当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能.这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍.

二、干燥

生物大分子制备得到产品,为防止变质,易于保存,常需要干燥处理,最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥.真空干燥适用于不耐高温,易于氧化物质的干燥和保存,整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同时增加了温度因素.在相同压力下,水蒸汽压随温度下降而下降,故在低温低压下,冰很易升华为气体.操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体,然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去.此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点,适用于各类生物大分子的干燥保存.

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系.干燥的制品一般比较稳定,在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化,贮藏要求简单,只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封,保持0－4度冰箱即可,液态贮藏时应注意以下几点.

1、样品不能太稀,必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏,样品太稀易使生物大分子变性.

2、一般需加入防腐剂和稳定剂,常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性.此外,钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用.核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中.

3、贮藏温度要求低,大多数在0度左右冰箱保存,有的则要求更低,应视不同物质而定.

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法

Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus

中国兽医协会发布

前言

本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。

本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。

1、范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。

本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2、规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室 生物安全通用要求

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3、试剂

3.1 DNA提取试剂

DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。

3.2 2 × PCR缓冲液

2 × PCR缓冲液的配制见附录A。

3.3 引物探针

3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：

上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：

上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR：

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

荧光探针ASF-OIE-Probe：

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

3.4 阴性及阳性对照

阴性及阳性对照的制备方法见附录C。

3.5 其他试剂

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。

消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。

4、仪器和耗材

分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。

5、操作步骤

5.1 样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。

5.2 样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

5.3 样品保存

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

5.4 病毒DNA提取

5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。

5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。

5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。

5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。

5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。

5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。

5.5 实时荧光PCR操作

5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。

5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。

5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。

5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

6、结果判定

6.1 结果分析条件设定

实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。

6.2 结果描述及判定

当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。

7、实验室生物安全要求

7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。

7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。

一

附录 A (规范性附录) 试剂的配制

A.1 DNA提取液1

PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。

A.2 DNA提取液2

1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。

即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。

A.3 2×PCR缓冲液

灭菌去离子水 70 mL

三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g

氯化钾 1.865 g

曲拉通X-100 0.5 mL

dATP (100mmol/L) 2.5 mL

dTTP (100mmol/L) 2.5 mL

dGTP (100mmol/L) 2.5 mL

dCTP (100mmol/L) 2.5 mL

六水氯化镁 0.61 g

盐酸 调pH至9.0

灭菌去离子水 加至100 mL

A.4 消毒液

8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。

A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方

A.5.1 A液

0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。

A.5.2 B液

0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制

取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。

A.6 无DNA酶的灭菌去离子水

无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。

二

附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列

1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA

61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT

121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT

181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT

241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT

301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT

361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC

421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT

481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC

541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA

601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA

661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT

721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT

781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT

841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC

901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT

961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC

1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG

1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT

1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA

1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC

1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA

1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA

1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT

1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC

1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA

1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT

1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT

1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG

1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA

1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG

1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT

三

附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C.1阳性对照

阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。

C.2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

四

附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D.1。

表D.1 实时荧光PCR反应液配方

组 分

1个检测体系的加入量

2×PCR 缓冲液a

12.5μL

dNTP（2.5 mmol/L）

1.0 μL

上游引物（10 μmol/L）

1.0 μL

下游引物（10 μmol/L）

1.0μL

探针（10 μmol/L）

1.0 μL

Taq 酶b（5U/μL）

0.5μL

去离子水

3μL

总体积

20μL

2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。

Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。

五

附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图

(资料来源：中国兽医协会）

准确的别名应该是：辛基苯酚聚氧乙烯(10)醚乳化剂TX-10

准确分子式应该是：C8H17C6H4O(CH2CH2O)10H

主要用作乳化剂，建筑行业用作沥青乳化剂

X-100 ：曲拉通，别名应该是：辛基苯基聚氧乙烯醚聚乙二醇辛基苯基醚

忘指正

X-100是一种非离子型去垢剂

分子式：C14H22O(C2H4O)n

用途：Triton

X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。

性质：

1.

Triton

X-100对细菌等微生物没有杀伤作用。

2.

Triton

X-100在紫外波段下有光吸收（lambda

max

=

275

nm

and

283

nm

in

methanol），因此，当缓冲液中存在Triton

X-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量。

3.

Triton

X-100常与CHAPS等zwitterionic

去垢剂一起使用来纯化膜蛋白，使膜蛋白保持其天然构象。

4.Triton

X-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性，因此在Immunostaining时常使用含

0.1%-0.5%Triton

X-100的PBS或TBS。

5.

Triton

X-100非常稳定，密封避光

+2

to

+8℃条件下可以长期保存。

6.Triton

X-100是透明，略显粘稠，稍微发黄的液体。

7.

Triton

X-100的密度为1.07

g/ml，pH6.0-8.0（5%的溶液）。

8.

Triton

X-100可以高压灭菌。

9.

用Triton

X-100来裂解细胞时，0.1%

Triton

X-100就足够了，不过，达到0.5%时也没问题。

10.

蛋白酶K在含1%

Triton

X-100的溶液中依然保持活性。

11.

可以使用Amberlite

hydrophobic

XAD

resins

and

Rezorian

A161

cartridges

来去除Triton

X-100

。

去垢剂(又称表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。

中性去垢剂又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal

CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex

LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。

Triton X-100是一种非离子型去垢剂分子式：C14H22O(C2H4O)n 用途：Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂）,常作为添加剂使蛋白保持稳定,尤其是膜蛋白. 性质： 1.Triton X-100对细菌等微生物没有杀伤作用. 2.Triton X-100在紫外波段下有光吸收（lambda max = 275 nm and 283 nm in methanol）,因此,当缓冲液中存在Triton X-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量. 3.Triton X-100常与CHAPS等zwitterionic 去垢剂一起使用来纯化膜蛋白,使膜蛋白保持其天然构象. 4.Triton X-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性,因此在Immunostaining时常使用含 0.1%-0.5%Triton X-100的PBS或TBS. 5.Triton X-100非常稳定,密封避光 +2 to +8℃条件下可以长期保存. 6.Triton X-100是透明,略显粘稠,稍微发黄的液体. 7.Triton X-100的密度为1.07 g/ml,pH6.0-8.0（5%的溶液）. 8.Triton X-100可以高压灭菌. 9.用Triton X-100来裂解细胞时,0.1% Triton X-100就足够了,不过,达到0.5%时也没问题. 10.蛋白酶K在含1% Triton X-100的溶液中依然保持活性. 11.可以使用Amberlite hydrophobic XAD resins and Rezorian A161 cartridges 来去除Triton X-100 . 去垢剂(又称表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多. 中性去垢剂又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用.一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200；多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌.中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂.

Triton X-100是一种非离子型去垢剂

分子式：C14H22O(C2H4O)n

用途：Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂）,常作为添加剂使蛋白保持稳定,尤其是膜蛋白.

性质：

Triton X-100对细菌等微生物没有杀伤作用.

2.Triton X-100在紫外波段下有光吸收（lambda max = 275 nm and 283 nm in methanol）,因此,当缓冲液中存在Triton X-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量.

3.Triton X-100常与CHAPS等zwitterionic 去垢剂一起使用来纯化膜蛋白,使膜蛋白保持其天然构象.

4.Triton X-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性,因此在Immunostaining时常使用含 0.1%-0.5%Triton X-100的PBS或TBS.

5.Triton X-100非常稳定,密封避光 +2 to +8℃条件下可以长期保存.

6.Triton X-100是透明,略显粘稠,稍微发黄的液体.

7.Triton X-100的密度为1.07 g/ml,pH6.0-8.0（5%的溶液）.

8.Triton X-100可以高压灭菌.

9.用Triton X-100来裂解细胞时,0.1% Triton X-100就足够了,不过,达到0.5%时也没问题.

10.蛋白酶K在含1% Triton X-100的溶液中依然保持活性.

11.可以使用Amberlite hydrophobic XAD resins and Rezorian A161 cartridges 来去除Triton X-100 .

去垢剂(又称表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多.

中性去垢剂又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取之用.一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如PEG200；多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯醇醚,如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚,如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌.中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢剂.