乳制品中游离甘氨酸的检测方法，最好是用液相色谱，紫外检测器的

这里有些资料，希望对你有用。

第一题相关资料：苯甲酸为无色、无味片状晶体。熔点122.13℃，沸点249℃，相对密度1.2659（15／4℃）。在100℃时迅速升华，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸，比脂肪酸强。它们的化学性质相似，都能形成盐、酯、酰卤、酰胺、酸酐等，都不易被氧化。苯甲酸的苯环上可发生亲电取代反应，主要得到间位取代产。

乳酸纯品为无色液体，工业品为无色到浅黄色液体。无气味，具有吸湿性。相对密度1.2060(25/4℃)。熔点18℃。沸点122℃（2kPa)。折射率nD(20℃)1.4392。能与水、乙醇、甘油混溶，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。在常压下加热分解，浓缩至50%时，部分变成乳酸酐，因此产品中常含有10%-15%的乳酸酐。

又名氨基乙酸，为非人体必需氨基酸。 名称缩写：Gly 甘氨酸是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水溶液中为强电解质，在强极性溶剂中溶解度较大，基本不溶于非极性溶剂，而且具有较高的沸点和熔点，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。

第二题相关资料：定义：由葡萄糖和果糖通过异头体羟基缩合而形成的非还原性二糖。具有甜味。 蔗糖是人类基本的食品添加剂之一，已有几千年的历史。是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高。以蔗糖为主要成分的食糖根据纯度的由高到低又分为：冰糖、白砂糖、棉白糖和赤砂糖（也称红糖或黑糖），蔗糖在甜菜和甘蔗中含量最丰富，平时使用的白糖、红糖都是蔗糖。

定义：一种最为常见的己酮糖。存在于蜂蜜、水果中，和葡萄糖结合构成日常食用的蔗糖。果糖中含6个碳原子，也是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体，它以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中，果糖还能与葡萄糖结合生成蔗糖。 纯净的果糖为无色晶体，熔点为103～105℃,它不易结晶，通常为黏稠性液体，易溶于水、乙醇和乙醚。果糖是最甜的单糖。

定义1：一种植物中广泛存在的贮存性葡聚糖。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；糖类（二级学科） 定义2：由D-葡萄糖单体组成的同聚物。包括直链淀粉和支链淀粉两种类型，为植物中糖类的主要贮存形式。 淀粉是葡萄糖的高聚体，在餐饮业又称芡粉，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖阶段为麦芽糖，化学式是（C12H22O11），完全水解后得到葡萄糖，化学式是（C6H12O6 ）。淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高。

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高效液相色谱法采用阴离子或阳离子交换色谱柱分离草甘膦和氨甲基膦酸,经柱后衍生,用荧光检测器检测。柱后衍生反应为先用次氯酸盐溶液将草甘膦氧化成氨基乙酸,氨基乙酸与邻苯二醛(OPA)和2-巯基乙醇(MERC)的混合液反应,形成一种强光的异吲哚产物。 取9.9m1均匀水样,加入0.1ml乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA),混匀,0.22um或0.45um滤膜过滤。若水样中草甘膦或氨甲基膦酸浓度低于25 ug/L时,取500m1水样分2次在旋转蒸发器中浓缩,缓慢升温至60℃,蒸干,加入2.9ml流动相和0.1 ml EDTA溶剂残渣,过滤。进样量200ul,外标法定量。 仪器条件色谱柱:阳离子或阴离子交换树脂柱,4.6mm×(25～30)cm,加热至50～60℃之间效率最大柱温:50 ℃流速:0.5 ml/min荧光检测器:激发波长Ex=230nm(氘)、340nm(石英卤素或氙),发射波长Em=420～455nm柱后反应条件:氧化剂流速:0.5ml/minOPA-MERC溶液流速:0.3ml/min。 标准溶液用水配制草甘膦、氨甲基膦酸均为0.1mg/ml标准储备溶液,稀释储备液配制浓度为10ug/ml, 1.0ug/ml系列工作液。储存于聚乙烯瓶中,冰箱保存,每月重新配制。

（一）原理

亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择

理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

（三）试剂与配制

1．Sepharose 4B

2．CNBr（剧毒）

3．抗原或抗体

4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5．0.1Mol/L NaHCO3

6．2Mol/L NaOH

7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml

0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml

NaCl 32.76g

加水至4 000ml。

8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

9．7Mol/L尿素

10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）

1Mol/L NaHCO3 100.00ml

NaCl 2.93g

加水至500.00ml。

（四）实验方法

1．琼脂糖活化

⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。

⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。

⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。

⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。

3．装柱

⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。

⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。

⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。

收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。

4．吸附与解吸附

⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。

⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。

6．结果判定

⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。

⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。