RNA 凝胶电泳注意事项

DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。

样品准备

6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。

样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。

标准分子／分子质量标记

琼脂糖凝胶中，指示剂溴酚蓝与分子质量大约600bp的DNA分子一起迁移，而二甲苯腈蓝则与大约4000bp的DNA分子共迁移。确切的迁移与琼脂糖的质量与浓度有关。

溴酚蓝与二甲苯腈蓝也可以用做聚丙烯酰胺凝胶中DNA的指示染料。

市场上有无数的DNA标准分子质量标记。其中大多数是已知DNA酶切产生的片段组合。这些标准DNA标记产生不同大小的片段，使人更容易快速估计未知片段的大小，也提供了胶与胶之间差异的参照。也可以自己制备标准，但是通常太麻烦，不值得这么做。

表1指示剂染料的迁移

 聚丙烯酰胺（％）溴酚蓝a二甲苯腈蓝a

聚丙烯酰胺凝胶   

 3.5100460

 5.065260

 8.045160

 12.02070

 20.01245

变性聚丙烯酰胺凝胶   

 5.035130

 6.026106

 8.01970-80

 10.01255

 20.0828

a 数值表示与染料共迁移的DNA 片段的大致长度（核昔酸对）

分子标尺是DNA梯子，各大小片段间有一定的间距。最适用于精确测定样品DNA的分子质量。大多数包含有明显可见的参考条带。

保留一份最常用的DNA 标准分子标记。两组有用的DNA 标准标记分别为(bp): λ／ Hind Ⅲ： 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125

ФX174/ Hae Ⅲ: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72

样式

中型胶盒vs 小型胶盒。小型胶用于监测酶切进程或者查看质粒抽提的质量，这是DNA

胶的两种最大用途。小型胶相对中型胶的优势在于电泳结束的时间较快（不到1 小时，中型胶3~4 小时）以及所需DNA 较少。Southern

印迹在大一点的胶上做较好，因为信号可能较弱需要较多的DNA 。

制备型胶VS 分析型胶。分析型胶用来收集信息。在制备型胶上，感兴趣的DNA 将被取走。制备型胶通常比较大，可容纳大批的样品。一块制备型胶可能只在胶的上端有一个极大的孔。

分离试剂

琼脂糖或者聚丙烯酰胺：分离能力VS 分离范围！

琼脂糖（分离范围大）的使用已经标准化，适于分离200bp-50kb 分子，水平方式电泳。10000kb 的DNA 可采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 。

用聚丙烯酰胺（分离能力好）来分离小的DNA 片段， 5bp-500bp, 通常制备成垂直式凝胶。碱性琼脂糖凝胶用来水解DNA

和分析单个DNA 链。使用碱性琼脂糖凝胶的原因通常是想查看cDNA 合成过程中第一步由逆转录合成的第一和第二条DNA

链的大小。往热的琼脂糖中加入碱液会水解琼脂糖，所以先以中性溶液制成胶，再在电泳前用新鲜配制的碱性电泳缓冲液平衡凝胶。

经化学修饰的低熔点琼脂糖在较低温度下融化(30’C 成胶， 65’C 融化） 。分辨力好于普通琼脂糖， 但不及聚丙烯酰胺。在冷库中跑电泳以防止琼脂糖凝胶的融解。低熔点琼脂糖很有用，因为有很多种方法从低熔点琼脂糖中回收DNA。

采用合适的琼脂糖浓度。见表2

表2 DNA 电泳所采用的胶浓度

种类成分分离范围

A琼脂糖（％）线性DNA 分子的有效分离范围(kb)

 0. 360~5

 0 .620 ~1

 0.710~0.8

 0 .97 ~0.5

 1.26~ 0.4

 1.54~ 0.2

 2 .03~ 0.1

B丙烯酰胺（％ ）有效分离范围（ 核昔酸对）

 3. 5100 ~ 1000

 5.080 ~ 500

 8 .060 ~ 400

 12 .040 ~ 200

 20.010 ~ 100

A 选择般能分开你要分析的D N A 大小的琼脂糖浓度。

B 如果你感兴趣的DNA 小于1kb, 可用聚丙烯酰胺凝胶。

缓冲液

制胶和实际电泳采用同种缓冲液。

如果用水代替缓冲液来配胶（这是最常犯的错误之一），胶上几乎没有电导， DNA就会移动得很慢或者根本不移动。这时候需要重新配胶。

最常用于DNA 的缓冲液是TAE (Tris－醋酸－ EDTA) 与TBE (Tris硼酸－EDTA),有时候也用TPE 。

用不同缓冲液来制胶、跑胶，结果有所不同。例如，双链线性DNA 片段在TAE 中比TBE 或者TPE 中迁移大约快15% ，而超螺旋DNA 的分辨率在TAE 中较好。

推荐使用TBE 。它具有最强的缓冲容量。

如果忘记在胶中加溴化乙锭，可以加到电泳缓冲液中。

表3 常用电泳缓冲液

缓冲液工作溶液高浓度贮液（每升）

Tris－乙酸(TAE)l X: 0.04 mol/L Tris- 乙酸

0.001 mol/L EDTA

50 X : 242 g Tris 碱

57.1 ml 冰乙酸

100 ml 0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0)

Tris – 磷酸(TPE)1 x : 0. 09 mol/L Tris- 磷酸

0.002 mol/L EDTA

10 X : 108 g Tris 碱

15 .5 ml 85 ％磷酸(1.679 g/ ml)

40 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8 .0)

Tris－硐酸a(TBE)0.5X: 0.045 mol/L Tris －绷酸

0.001 mol/L EDTA

5 X: 54 g Tris 碱

27 .5 g 硐酸

20 ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)

碱b1 X : 50 mN NaOH

1 mmol/L EDTA

1 x: 5 ml 10 N NaOH

2 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)

a 高浓度TBE 长时间储存会产生沉淀。为避免产生沉淀，储存5 X 溶液于玻璃瓶，室温， 丢弃任何有沉淀的批次。TBE 的琼脂糖凝胶电泳最初采用1 X 的工作强度（即1：5 稀释高浓度贮液），但是0.5 x 的工作溶液能提供足够的缓冲能力。现在几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10 稀释贮液来进行。TBE 的聚丙稀酰胺凝胶电泳是用1 X 工作强度进行的，是通常琼脂糖凝胶电泳强度的两倍。用于聚丙稀酰胺电泳垂直槽的缓冲液的贮备液很小，而穿过其中的电流量很大。需要1 X TBE 来提供足够的缓冲能力。

b 碱性电泳缓冲液应该新鲜配制。

电源

电压的使用。随着电压的增大，琼脂糖凝胶的分辨有效范围减小。为获得大于2kb的DNA 片段的最佳分辨率，以5V/cm

或者更低的电压进行电泳（两个电极之间的距离，cm) 。5-10 V/cm 可适用于大多数的胶。对一些缓冲液来说， 100 V 大约是50 mA 。

如果电泳过夜，总电压可以是20-25 V 。可以在第二天早上调高电压。

采用稳功率而不是稳压或者稳流可以防止大的电压峰或者产生过热。

以比普通胶慢得多的速度电泳低熔点胶，避免产热。

染色

胶融化之后加入溴化乙锭。每10 ml 琼脂糖溶液加1 μI 10 mg/ml 的溴化乙锭。

并不一定要往缓冲液中加溴化乙锭，可以在电泳后染色，胶体中的溴化乙锭已足够看到大多数条带。

分析

胶中的DNA 可以通过紫外透视灯观察。

戴手套，把胶平放在塑料薄膜上。可以用一个托架或者盘子来移取胶／塑料薄膜，但是托盘将会吸收过多的紫外线，可能看不到染色较浅的条带。

没有经RNA 酶处理的DNA 胶经常可以看到在胶的底部类似扩散条带的tRNA 。

为什么会有这么多的DNA 条带？即未被酶切的质粒DNA 可能在胶上呈现不止一条。

因为超螺旋环形（未被酶切） 、带切口环形（部分酶切）以及线性（完全酶切） DN在胶上以不同速度迁移，因此一个未完全酶切的DNA 可能显示三条不同的条带。

很难预测哪一条带是哪一个DNA, 因为琼脂糖浓度、电流强度与缓冲液类型都有一定影响，但是一般来讲，超螺旋DNA 像一颗致密子弹一样穿过凝胶，跑得最快，线性及切口DNA 紧随其后。

制胶

琼脂糖凝胶

DNA 胶现配现用。事先配制的胶可以储存在电泳缓冲液中或者包在塑料薄膜中， 置于冰箱过夜。

利用稀释后的10X 贮液和琼脂糖来制胶。在三角烧瓶中配制所需的量，或者在玻璃瓶中配制足以制成几块的胶。琼脂糖会固化，但是可以在微波炉中重新融化。储存琼脂糖／缓冲液＂溶液＂于室温。

琼脂糖有几个级别。越纯（越昂贵）污染的蛋白质越少，盐类与其他多糖等污染物也越少。也有适于分离不同大小核昔酸的琼脂糖。如果需要回收DNA, 使用你能承受的最贵的琼脂糖，因为污染物可能抑制酶活性，成为成功克隆的主要障碍。

微波炉加热

把盖子松松地放在瓶子上，必须能让空气流出，否则瓶子有可能爆炸。如用的是烧瓶，用大一点的，减少暴沸的可能。你可以让口开着或者用塑料膜松松地扎在开口上，不要用铝箔！

把微波炉调到高温。新鲜配制的琼脂糖比固化的琼脂糖需要更长的加热时间。100 ml 可能需要3~5mm，更多的话大约6-l0min 。

1 min 后，停掉微波炉，戴着手套抓住瓶子，摇转瓶子及其内容物。混合均匀的东西加热得更快更平稳。

把瓶子放回微波炉中再加热。1 min 后停止，摇匀。

再把瓶子放回微波炉加热，直到即将沸腾。

用夹子或者耐热手套取出瓶子。

待琼脂糖冷却，直到能用手触摸。倒胶之前摇匀。如果发现部分琼脂糖已经开始固化，用微波炉稍稍加热一下。

使用时加样量不同

10*的染料会比6*的多一种，即二甲苯腈蓝FF，它跑在溴酚蓝后面

百科上说：

二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。

6Xloading buffer是用来上样的；10Xloading buffer是stop buffer，是停止酶促反应的，如果一定要用10Xloading buffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10Xloading buffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右）。

使用时加样量不同 10*的染料会比6*的多一种，即二甲苯腈蓝FF，它跑在溴酚蓝后面 百科上说： 二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。 6Xloading buffer是用来上样的；10Xloading buffer是stop buffer，是停止酶促反应的，如果一定要用10Xloading buffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10Xloading buffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右）。

使用时加样量不同

10*的染料会比6*的多一种，即二甲苯腈蓝FF，它跑在溴酚蓝后面</ol>百科上说：

二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。6Xloading buffer是用来上样的；10Xloading buffer是stop buffer，是停止酶促反应的，如果一定要用10Xloading buffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10Xloading buffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右）。