DNA 提纯的方法

Bio Flux公司的核酸纯化柱，原理就是使用一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离液剂（盐酸胍，NaI, NaClO4）的条件下，可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其它杂质 不会被吸附， 从而达到纯化核酸的目的。

1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

2)RNAgents®总RNA提取系统的工作原理怎样？

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

6)对初始材料的用量有什么限制？

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

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1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

Promega用于提取总RNA及poly(A)+RNA的系统包括：

：用RNAgents®总RNA提取系统从组织及培养的细胞中提取总RNA。

：用SV总RNA提取系统从组织，血液及培养的细胞中提取总RNA。

：用PolyATtract®mRNA提取系统从总RNA中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®ystem1000从组织及培养的细胞中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®Series

9600TMmRNA从少量样品中快速提取mRNA（cDNA第一条链的纯化）。

2)RNAgents®提取总RNA提取系统的工作原理怎样？

RNAgents®总RNA提取系统用溶剂法为基础，从多种材料中快速，有效地提取总RNA。

简单而言，有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩。用RNAgents®总RNA提取系统所得RNA纯度好，用途广，适用于PolyATtract®mRNA提取系统。如RNA中必须完全去除染色体DNA，需用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理。然后用65oC加热10分钟，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

得率受多个因素的影响，包括组织来源及培养的细胞数。如提取的RNA量多，可通过光吸收测定（A260读数）来定量RNA，

1OD=40ugRNA。

RNAgents®总RNA提取系统的一般得率

组织

总RNA得率

Hela细胞

1.6mgRNA/10的8次方个细胞

鼠内脏

2.3mgRNA/g组织

鼠脾

8.3mgRNA/g组织

鼠肺

1.9mgRNA/g组织

鼠肾

3.1mgRNA/g组织

鼠肝

8.1mgRNA/g组织

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

(1)

变性剂:

柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸

。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。

(2)

苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。

(3)

乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。

(4)

异丙醇：沉淀浓缩RNA。

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

苯酚：氯仿：异戊醇的配比是125：24：1，用42mM柠檬酸钠溶液平衡(pH4.3-4.7)。这一配比可有效去除染色体DNA。残留染色体DNA会干扰RT-PCR。

6)对初始材料的用量有什么限制？

最初的设计方案是用作提取比较大量的RNA，RNAgents®总RNA提取系统可从5mg

组织，或5倍10的5次方的细胞中提取RNA。少量RNA提取的步骤可见RNAgents®总RNA提取系统技术手册TB087。初始材料用量的上限是每次用1g组织。

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在变性溶液中液化和沉淀的步骤。简化的步骤可在90分钟内完成。

http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm

亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择

理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

（三）试剂与配制

1．Sepharose 4B

2．CNBr（剧毒）

3．抗原或抗体

4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5．0.1Mol/L NaHCO3

6．2Mol/L NaOH

7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml

0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml

NaCl 32.76g

加水至4 000ml。

8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

9．7Mol/L尿素

10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）

1Mol/L NaHCO3 100.00ml

NaCl 2.93g

加水至500.00ml。

（四）实验方法

1．琼脂糖活化

⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。

⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。

⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。

⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。

3．装柱

⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。

⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。

⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。

收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。

4．吸附与解吸附

⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。

⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。

6．结果判定

⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。

⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

0 T3 z( F&_, D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步骤

- O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。( O( g^+ K) f+ i&]% P

实验步骤：

* l&d6 s5 e( q1 F( g2 | j, ^0 s 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6 D8 }. QY, g* X

1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

" s% f, `0 [1 d* m! ]0 e2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

&X. P) i) YL# u/ [3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。2 @0 d&z7 ?+ i, g1 @

4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、 融解RNA一般使用TE。

L5 f. n6 }( S1 t% Z&J6、 保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

&P3 [7 m* ^$ U$ _" ?

: F" x u* N( ?( I氯化锂法提取总RNA：

" u}' I! r' ^' ^&l 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。# ~* S: }9 `* r4 Z3 P

试验试剂：

" d$ r6 Q+ _. I8 Q1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】

7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】

! m8 Q4 R, ]&y: b# `7 d试验步骤：7 [6 ?$ `* }o7 _ Z' {

1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y) b: E, Q" l/ ^ Q: \$ s

2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。 x- C6 D- N/ N0 K! t2 a

3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。

) y- x) S0 K9 y6 j, e4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。

3 d2 v' i1 ~( ~* D5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。

L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3 }r0 [/ Q' G9 q

7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。

0 f. X% R( H% B7 g

! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶－热酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l

本方法适合于病毒RNA的提取

* I( i+ b# r! K试验试剂：

$ ?4 [7 H9 `) J1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml）, J5 p l6 V/ t7 [/ I

2、 2×缓冲液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h, p ] y+ \$ Z) O

试验步骤：# W3 v8 G1 [$ ]5 y

1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。

- K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n, {# d2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。

w! `W( ~, E: i3 ^3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。, |( Z0 dj2 @7 m+ d2 Q&x H

4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。

7 [/ w, h2 d6 U$ k5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。

% A5 Y{( w% ]3 a* y, O e) P6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策