乙醇连续发酵中温度对菌体比生长率的影响（要有公式和文献为证）

文章在下面，具体自己看，图本来有5张，但是不知道怎么都传上来，所以只把最关键的图给你了，希望有用

乙醇连续发酵一渗透汽化耦合系统发酵动力学研究

乙醇连续发酵动力学

乙醇作为一种可再生燃料资源引起了广泛关注，这不仅是因为石油储量的日益减少，更是由于乙醇比石油类燃料更环保。发酵法生产乙醇是一个产品抑制过程，连续移走产物乙醇可减弱甚至消除其抑制作用，得到较高的乙醇体积产率。目前所采用的原位分离技术有：真空蒸馏、吸附、萃取、膜蒸馏以及渗透汽化等。其中渗透汽化与乙醇发酵耦合因其低耗高效且对细胞无毒害而受到国内外许多学者的重视和广泛探讨。Mori等人[1]利用PTFE-silicone平板膜构成的渗透汽化膜生物反应器进行直接用未经蒸煮的淀粉为原料的乙醇间歇补料发酵。与传统发酵相比，淀粉利用率大大提高，乙醇产率增加2．25倍。但其选用菌种的乙醇生产能力较酿酒酵母低很多，故乙醇体积产率只有0．36g·h L- 。Ikegami等人[。]和Nomura等人[。]也都采用渗透汽化与发酵耦合系统，以工业用干酵母为实验菌种对乙醇连续发酵进行实验。由于选用的硅沸石膜对乙醇有很高的选择性，得到的乙醇产品浓度分别达到70％ (wt)和98.2％ (wt)，但由于膜通量太小，且膜污染问题严重，在一定程度上限制了其向更大规模发展。本实验室通过自制的平板PDMS复合膜组件及发酵系统来构造硅橡胶膜生物反应系统，使乙醇产率较传统间歇发酵有很大提高，且整个实验过程中未出现膜污染及膜性能下降等问题。此次在前期实验基础上进行放大实验，由前期圆形膜器扩大膜面积为矩形膜器，发酵规模也扩大了一倍。以相

同条件进行乙醇连续发酵与渗透汽化耦合实验，分析乙醇发酵动力学问题，对进一步扩大连续发酵生产乙醇规模有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验菌株及培养基

菌种：实验所选菌种是湖北安琪酵母股份有限公司生产的工业用耐高温酿酒活性干酵母(thermophilic

alcohol active dry yeast(TH—AADY))，具有耐高糖和乙醇的特点。取4g干酵母在温度为35－40℃的自来水中复活20min作为种子液备用。

培养液：培养液的组成(g／L自来水)：CaClz 0．15、酵母膏8．0、(NH4)2 SO4 5．0、葡萄糖100、KH2Po41．5、MgSo4·7HzO 0．55

其中葡萄糖为工业级，其它化学药剂为分析纯，高温灭菌培养液，并冷却到常温后混合备用。

1.2 膜

PDMS复合膜：本实验中采用自制的厚度为128 m(硅橡胶活性皮层厚度为8 m；多孔支撑层为聚酰胺微孔膜，厚度为120gm，平均孔径为0．45um)的硅橡胶(PDMS)复合膜。矩形平板膜组件：膜器为板框式结构，尺寸为300×300mm，单张膜有效面积为0.08m2，可通过叠加多张膜增大有效面积，本实验采用单张膜。该膜器为一维平板薄层流道，其模型溶液(5 乙醇水溶液)的渗透汽化实验已在肖泽仪等[4]的文章中有详细说明。前期实验采用的圆形膜器直径200mm，有效膜面积为0．024m2，一维环形流道。

1．3 反应器系统及流程

发酵一渗透汽化膜生物反应器实验系统如图1所示，在有效体积为5L发酵罐中加入预先配好的发酵培养基，接人种子液进行发酵，并在发酵前期对发酵液进行鼓氧，使细胞快速生长。发酵温度控制在35±1℃，pH值通过滴加氨水调节，使其稳定在4.5±0.5，并通过滴加葡萄糖液维持发酵罐中葡萄糖浓度和发酵液体积。下游冷阱温度设为-30℃，当发酵液中乙醇达到一定浓度时，发酵与渗透汽化过程耦合，在膜下游真空泵作用下，保持1.067kPa真空度。发酵液通过循环泵以110L/h叫的流量在膜上游与发酵罐间循环，并在膜器内进行渗透汽化，透过膜的乙醇蒸汽在冷阱中冷凝下来。发酵过程中71h到l16h进行了45h发酵与渗透汽化耦合连续过程，其它时间采取白天耦合、夜间无基质加入及产物取出的纯发酵方式。本系统运行到第12天，活细胞比率降至50 9／5以下，且发酵罐中乙醇浓度降至18．8g·I ～ ，葡萄糖消耗量也明显下降，以此判断到达发酵终点，整个发酵过程持续269h。

同时，以相同的培养基以及葡萄糖初始浓度进行间歇发酵实验，实验过程中除取样少量消耗，无其

它基质及产物的取出。基质和产物浓度均稳定不变后发酵达到终点。

1．4 分析方法

取样时将一定体积的发酵液用孔径0．8gm的微孔膜过滤掉细胞后蒸馏，然后分别测定馏出液中

乙醇浓度和蒸馏残液中葡萄糖浓度，并由此推算发酵罐中乙醇和葡萄糖浓度。蒸馏后乙醇和葡萄糖浓度均用密度仪(DMA45O0，Anton Paar，Austria)测定。      细胞浓度用两种方法测定：将一定体积发酵液用孔径0．8um微孔膜过滤截留细胞，在60℃下烘干后用精度为0.001mg的电子天平(AR2130／COHAUS USA)称干重；酵母数(个／mL)用血细胞计数板通过荧光显微镜(BI-220 ASC MOTIC)计数，并通过用亚甲基蓝溶液对细胞染色来计算酵母活细胞比率。

2 结果与讨论

实验计算数据如表1所示，按照纯发酵过程和发酵与渗透汽化耦合过程以及综合过程三种情况分

析实验数据。其中乙醇得率系数Yp／s由公式Yp／s=rp／rs得到；细胞得率系数Y s由公式Y s—rx／rs计算；乙醇转化率为：乙醇实际得率系数／乙醇理论得率系数；乙醇理论得率系数按照lmol葡萄糖转化生成2mol乙醇可计算得0.511。由表中可以看出，通过渗透汽化连续移走发酵液中生成的乙醇，可使上游乙醇浓度维持在40g/L。而渗透液中乙醇浓度可达190 g/L左右，浓缩近5倍。且连续发酵乙醇体积产率比间歇发酵提高2．5倍，其中耦合阶段乙醇体积产率更是比间歇发酵提高了4．5倍，发酵液中酵母浓度也为间歇发酵的2．3倍。由此说明连续发酵比间歇发酵环境有较大改善。连续发酵过程中，耦合过程比纯发酵过程细胞得率系数高60%，耦合过程的发酵状况明显好于纯发酵过程。但由于细胞自身代谢消耗基质，乙醇得率系数较间歇发酵有所降低。矩形膜器与圆形膜器相比，各参数都略有提高，但变化不大。说明乙醇发酵与渗透汽化耦合稳定，同步增大发酵规模和膜面积达到大规模连续发酵是可行的。而且发酵环境随着膜器的改进也有所改善，更利于发酵向生成乙醇的方向进行。

葡萄糖是本实验中酵母细胞生长的唯一碳源，在发酵液中缺乏或者过量都可能对细胞生长造成不良影响。伍勇[5]等通过三水平正交实验得到在葡萄糖浓度在10一60g/L 范围内对细胞生长无明显基质抑制现象，故在考察硅橡胶膜生物反应器中的细胞生长动力学时，可不计基质抑制效应的影响。但可能存在基质限制问题，即糖浓度过低，导致细胞处于饥饿状态，最终影响乙醇产率。

乙醇是细胞生长代谢产物，其在发酵液中的积累会抑制酵母细胞的生长。实验证明，在乙醇浓度达到90g/L时，酵母细胞的生长被完全抑制。要使发酵过程能够连续进行必须保持发酵液中乙醇浓度处于较低水平。乙醇连续发酵动力学曲线如图2所示。发酵48h后，发酵罐中乙醇浓度达到70g/L、细胞浓度达到10g/L叫便因抑制不再增加，从此时乙醇发酵与硅橡胶膜渗透汽化过程进行耦合。乙醇浓度随着渗透汽化的进行迅速降低，维持在40g/I 以下，对细胞生长抑制作用明显减弱，细胞浓度又开始增大，并在lOOh后达到20g·L- ，发酵状态稳定后一直维持在20一25g·L一，最高细胞浓度达到27.5g/L 。从图2日间耦合、夜间纯发酵阶段可以看出，通过夜间的纯发酵过程，乙醇浓度在白天渗透汽化开启之前都有一个增长过程，随着渗透汽化的进行，发酵液中乙醇浓度又有很明显的下降趋势，由此可知膜渗透汽化速度大于乙醇生成速度。71h到116h系统连续运行详细情况如图3所示。在45h无间断耦合过程中，发酵及渗透汽化性能稳定，随着渗透汽化的连续作用，乙醇浓度持续下降，并最终达到稳定状态35g/L，相应的膜下游乙醇产品浓度也由25 (wt)下降并最终稳定在17 (wt)左右，说明这个时候乙醇的生成速率与渗透汽化分离速率达到平衡。

提高发酵液中菌体浓度也是实现高强度乙醇连续发酵的一个重要方面。在实验中以4h为单位时

间计算得到酵母细胞比生长率随发酵及渗透汽化作用的进行而变化的情况如图4所示。在前25h内酵

母以较大比生长率快速繁殖，但由于乙醇抑制作用，比生长率快速下降，直至降到0，即细胞停止生长。在渗透汽化作用下比生长率又有所升高，细胞浓度开始快速升高，并最终达到20g/L 以上。在随后的过程中虽然比生长率有或高或低波动，但浮动幅度比较小，基本稳定在0，即细胞浓度在稳定的发酵一渗透汽化过程中长时间维持不变，说明进入稳定状态后，细胞的生长速率和死亡速率达到动态的平衡。在提高菌浓度的同时还要考虑菌体活性，随着实验的进行，细胞的老化是不可避免的，如何实现细胞更新，保持发酵罐内细胞的高活性将是下一步实验需要解决的问题。

乙醇连续发酵过程的269h内，发酵罐中乙醇浓度保持在比较理想的范围50—30g/L，尤其在系统稳定后，基本维持在35—45g/L，这就保证了整个系统在较长时间内在低产物抑制的状态下稳定运行。前期实验[6]已证明，在发酵液复杂产物中乙醇产量比其它挥发性产物至少高3个数量级，分析计算时可将发酵产物看作只有乙醇，但长时间连续发酵一渗透汽化过程还是需要解决副产物积累对发酵的抑制问题。

连续发酵过程中硅橡胶膜表现出良好分离性能，在发酵液乙醇浓度范围为70一30g/L 时得到

浓度为28.2—16.5 (wt)的乙醇产品。渗透总通量达到1226—707g·m-2/h，乙醇渗透通量达到

292.3一l16.6g·m-2/h。，分离因子为8.5—4.9。由图3中可以看出，随着渗透汽化的进行，分离因子在正常范围内波动，但总通量和乙醇通量都有所下降，这是由于膜的分离能力大于发酵产出乙醇能力，随着分离作用的不断进行，上游乙醇浓度不断降低，导致下游通量的下降。这说明要与膜的分离能力相匹配，上游的发酵规模可以更大。前期圆形膜器实验中，在发酵液乙醇浓度范围为92.7—38.9g/L时，下游渗透总通量达到149O一1164g·m-2/h，分离因子为7.8—6.9，扩大实验规模后渗透汽化参数无不利变化。下一步实验将通过采用两级冷凝收集乙醇的方式提高二级乙醇产品浓度，以大幅度降低生产无水乙醇所需能耗。

3 结论

通过乙醇连续发酵一渗透汽化耦合实验和发酵动力学研究发现，渗透汽化膜选择性分离出产物乙

醇，将发酵液中乙醇浓度降低并保持在40g/L左右，减弱甚至消除了乙醇对酵母细胞的抑制作用，大大延长了一批细胞的发酵时间，并显著提高了发酵罐内的细胞浓度、乙醇体积产率和基质消耗速率。发酵一渗透汽化连续耦合阶段的乙醇体积产率维持在3．4g/h/L。，显著高于间歇发酵值。通过圆形膜器与矩形膜器的比较，发酵性能参数以及渗透汽化参数基本不变，说明扩大发酵一渗透汽化耦合实验规模并未对发酵环境以及渗透汽化作用产生不良影响，且通过对发酵规模和膜面积的相应放大来扩大整个连续发酵过程是可行的，这对于进一步扩大连续发酵规模具有重要指导意义。

系统运行过程中膜性能稳定，但长时间操作使得发酵罐内非挥发性副产物积累及细胞活性降低，

导致乙醇体积产率有所下降。进一步实验将考虑对发酵液进行定期部分更新，以维持更好的发酵环境。

参考文献

[1] Y．Mori；T．Inaba，Ethanol production from starch in a pervaporation membrane bioreactor using dostridium thermohydrosulfuricam，Bioteehnology and Bioengineering，1990，36l849- 853

[2]T．Ikegami；H．Yanagishita；n Kitarnoto；H．Negishi，Coneentration of fermented ethanol by oervaooration using silicalite menlbran~coated with silicone rubber，Desalination，2002，149：49-'-54

[3]M. Nomura；T. Bin；S Nakao，Selective ethanol extraction from fermentation broth using a silicalite membrane，Separation and purification technology，2002，27：59．一66

[4]肖泽仪；汤明；黄卫星；等，PDMS复合膜薄层流动膜组件中的渗透蒸发传质动力学，四川大学学报(工程科学版)，2005，37(6)：46—51

Is]伍勇；肖泽仪；黄卫星；等，酿酒酵母在硅橡胶膜生物反应器中连续发酵的生长动力学，现代化工，2004，24(1)：34—39

[6]Wu Yong；Xiao zeyi ；Huang Weixing；et a1．，Mass transfer inpervaooration of active fermentation broth with a composite PDMS membrane。Separation and purification technology，2005，42：47— 53