硫酸葡聚糖简介

需要看原始浓度是多少，商品给的是mol浓度，还是质量。如果是质量的话，直接将50g的硫酸葡聚糖加到100ml蒸馏水中溶解就可以了。

作用可以有效地提高脂蛋白酶的活力，促进酯酶游离到血液中，分解乳糜微粒，澄清血脂。

降低血清中总胆固醇含量，解除β-脂蛋白及纤维蛋白对血管壁的亲和力；可拮抗玻璃酸酶的作用，降低血管壁的正常代谢。

肝素最常见的不良反应

肝素的主要不良反应是易引起自发性出血，表现为各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等，而肝素诱导的血小板减少症是一种药物诱导的血小板减少症，是肝素治疗中的一种严重并发症。药物所致的血小板减少症主要分为两型 ：

(1)骨髓被药物毒性作用抑制所致

(2)药物通过免疫机制破坏血小板所致。后者中以肝素、奎宁、奎尼丁、金盐与磺胺类药物发病较高。临床症状极不一致，血小板减少至(1.0～80)×10 9 /L，轻者无症状，重者可因颅内出血或因肝素导致内皮细胞的免疫损害，合并危及生命的肺栓塞与动脉血栓形成致死。

诊断主要依靠:

(1)药物治疗期间血小板减少

(2)停药后血小板减少消除。严重患者血清中可检出药物依赖性血小板抗体，但敏感性不高而常呈假阴性。

治疗的关键是:立即停用相关药物，严重病例可使用输注血小板、激素、丙球甚或血浆置换。

肝素不宜用于 溶血 尿毒综合征。溶血尿毒综合征(HUS)是小儿急性 肾功能 衰竭常见病因之一。 儿童 期典型 腹泻 后HUS90%由出血性大肠杆菌O157:H7引起。目前认为 HUS发病的中心环节是内毒素启动内皮细胞受损，继而出现凝血系统激活，炎症介质释放，内皮素-一氧化氮轴紊乱等多环节参与发病。全身各器官均有不同程度受累，主要是肾脏，其次是脑。治疗上强调支持疗法和早期透析，典型HUS的治疗不提倡应用肝素、抗生素和激素。不典型HUS可适用血浆置换，有一定疗效。

肝素的检测

APTT

APTT依然是作为监测UFH的选择之一。它是非常简单，快速和便宜的项目。然而，却难以标准化。APTT检测需要整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，从而可以准确测量肝素水平。有狼疮抗凝物或抗磷脂综合症的病人通常都有APTT升高，他们就必须使用肝素试验来监测。除了不同凝血因子水平的因素，试剂和仪器会影响其对肝素的敏感性，导致在实验室之间结果最终会有多达四倍的差异。 国际 血栓与止血协会和标准化委员会(ISTH SSC)企图建立一个标准方法，类似PT实验中使用的ISI一样，给APTT试验建立一个纠正系数。但是由于磷脂，激活剂和仪器种类的多样化，这一工作只取得了一点进步。ISTH建议每个APTT的检测系统都应当采用推荐的方法，通过肝素抗Xa活性来进行定标并获得相应的APTT监测范围。

硫酸鱼精蛋白中和试验

该试验是基于UFH，一个高度负电荷的分子，被硫酸鱼精，一个正电荷的蛋白，中和的原理。配备不同浓度的硫酸鱼精蛋白加入血浆中，再加入凝血酶，测量凝固时间。将凝血酶凝固时间恢复至正常的硫酸鱼精蛋白浓度就被认为是肝素的浓度，这个过程仅仅用于UFH。

抗Xa活性检测

发色底物法检测肝素抗Xa活性的原理都是一样的：标本中的肝素与AT形成复合物，抑制过量添加的Xa因子。剩余的Xa因子活性的测量，通过其与特异的底物作用，释放出pNA来进行。这一反应与肝素浓度成反比。不同的只是反应孵育时间，稀释用的缓冲液，底物以及是否添加外源的AT。缓冲液中的硫酸葡聚糖可以降低PF4的影响。

一步法检测

一步法测量肝素使得检测更加简单，并缩短了时间。这种方法不添加外源性AT。

检测是基于竞争抑制原理。加入Xa到血浆中与底物混合，立即同时有2个反应：底物被Xa水解和Xa被肝素-AT复合物抑制。一旦反应达到平衡，底物中释放出的pNA与待测血浆中肝素浓度成反比。在这个检测中，没有添加外源性的AT，完全依赖病人血浆中的AT数量。这就代表了病人真实的肝素功能反应。病人AT水平在35%-130%之间，肝素浓度检测不会受到影响。

肝素的适应症

1.羊水栓塞、死胎综合征、异型输血反应、暴发性 紫癜 、脓毒血症、 中暑 及转移性癌肿但对蛇咬伤所致DIC无效。

2.作为体外(如输血、体外循环， 血液 透析，腹膜透析及血样标本体外实验等)抗凝剂。

3.有报道，肝素能促进脂蛋白脂酶(清除因子)从组织释放，后者再催化三酰甘油水解，从而清除 血脂 还能增强抗凝血酶Ⅲ对血管舒缓素的抑制作用，因而可抑制遗传性血管 神经 性水肿的急性发作。

猜你喜欢：

1. 肝素的作用及不良反应

2. 最常见的输血不良反应

3. 苯海拉明最常见不良反应

4. 肝素的不良反应

5. 常用急救药品试题及答案

【关键词】 多糖；,,,微生物；,,,药用；,,,生物合成

摘要： 活性多糖是新药研发中的一个热点，其中研究相对较多的是来源于微生物的多糖。近年来，关于微生物多糖的研究有了进一步的发展，本文对药用微生物多糖在生物合成、作用机制和构效关系等各方面的最新研究进展进行了综述。

关键词： 多糖； 微生物； 药用； 生物合成

Advances in the research of active polysaccharides derived from microbes

ABSTRACT Over the past few years, many advances have been made toward research on active polysaccharides especially microbial polysaccharides, it becomes a hot spot in new drug research and development. This review will focus on recent studies that illustrate the biological activities, mechanisms of action and structurefunction relationships of microbial polysaccharides for drug use.

KEY WORDS Polysaccharide Microorganism Drug use Biological activities

多糖广泛分布于高等植物、地衣、海藻、动物和微生物中。微生物来源的多糖是至今研究得比较详细的一类多糖，其广泛的生物活性使得其已成为微生物药物一个重要的组成部分，且在新药研发中越来越受到重视。本文对迄今为止所发现的微生物多糖的药用生物活性进行了综述，并总结了近年来关于多糖构效关系和作用机理方面的研究成果。

1 免疫调节功能

免疫调节剂在疾病治疗中的作用越来越受到重视。多糖免疫调节剂于40余年前被首次发现，近二十年来，有更多微生物来源的多糖被确认对机体免疫反应的调节有着极为重要的意义。这些多糖的免疫调节作用涉及到免疫系统的各个方面，对于其免疫调节机制的研究也体现在各个层次上，对这些多糖分子决定它们与宿主免疫系统相互作用的结构特征也已经进行了更为深入的研究。以下对几种比较典型的免疫调节剂分别进行介绍。

1.1 两性离子多糖 两性离子多糖(zwitterionic polysaccharides,Zps)是有同时含有阳离子和阴离子结构以实现其生物功能的一类多糖。多糖A(PS A)是Zps的分类原型。PS A是从革兰阴性厌氧菌脆弱拟杆菌中分离得到的两种荚膜多糖中的一种。Zps在菌体表面组装成荚膜多糖复合物(CPC)。早期研究证明，CPC能调节腹腔内脓毒症伴随性脓肿的形成〔1〕。CPC的腹膜内给药能诱导脓肿形成，而皮下和肌肉的预防性给药则能防止宿主在细菌感染后形成脓肿。一方面，在诱导脓肿形成过程中，Zps扮演了多重角色，它能诱导细菌在腹腔间皮表面的粘附，并能刺激某些促免疫细胞因子和化学增活素，进而诱导宿主细胞CAMs的表达，完成腹腔内多形核白细胞的募集。另一方面，Zps预防脓肿形成、保护机体免于免疫反应的作用，并非是作为一种经典的免疫原去介导特异性的免疫反应，而是对宿主的免疫系统进行调节，从而对导致脓肿形成的免疫反应实现全面抑制。其具体机制是Zps对CD4+T细胞活性和IL2生成的调节〔2〕，而IL2似乎是Zps调节机体免疫以预防脓肿的中心环节〔3〕。对于其构效关系的研究表明，Zps同时含有阴阳电荷基团的重复单元是其免疫调节作用的关键性结构，破坏多糖的电荷结构能使其活性显著降低〔4〕。

1.2 β(13)葡聚糖从酵母和真菌中纯化得到的β(13)葡聚糖是另一类免疫调节剂。沿着β(13)葡聚糖主链随机分布着β(16)葡聚糖基支链。Williams等证明β(13)葡聚糖能显著增加动物体内嗜中性粒细胞水平并增加骨髓细胞的增殖。PGG是Williams研究组经高度纯化已获专利的一种β(13)葡聚糖。PGG给药后，嗜中性和嗜酸性粒细胞的比例增加，从给药小鼠体内得到的嗜中性粒细胞，在体外对大肠埃希菌的吞噬作用增加〔5〕；巨噬细胞的形态发生改变，巨噬细胞同时表现出磷酸酶活性增加和脂多糖(LPS)刺激的NO生成的特征〔6〕。研究表明，β(13)葡聚糖能调节淋巴细胞和单核细胞中促免疫细胞因子的产生〔7〕。β(13)葡聚糖对NFκB样和NFIL6样转录因子的调节作用具有时间和浓度依赖性〔8〕。其所涉及的信号转导通路与超抗原LPS不同。PGG用于预防治疗也获得了肯定的实验结果。能显著降低腹腔内脓毒症的致死率。Williams在脓毒症小鼠模型试验中研究了β(13)葡聚糖对转录激活、细胞因子表达的影响，发现与对照动物相比，NFκB和NFIL6的核结合活性降低，TNFα和IL6的mRNA水平也有所下降。转录因子活性和细胞因子表达的下调和败血症动物的存活率升高是正相关〔10〕。β(13)葡聚糖的免疫调节生物活性基于它们与巨噬细胞和多形核中性粒细胞(PMNs)的直接作用。Muller等的工作表明，磷酸葡聚糖，一种水溶性的(13)βD葡聚糖，能够与人或鼠的单核/巨噬细胞结合。这种结合特异地导致了外来细菌的内在化和增加的胞浆空泡化〔11〕。β(13)葡聚糖的免疫调节还涉及到补体途径。补体受体3(CR3)也已经被确认是某些葡聚糖的受体〔12〕。CR3介导的吞噬作用和脱颗粒作用需要CR3结构域上一个iC3b结合位点和一个葡聚糖结合位点同时与配基的结合。用抗PGG葡聚糖受体的单克隆抗体对中性白细胞处理，可以抑制NFκB样因子的激活〔13〕。将酵母菌株煮沸和酶处理得到可溶和不可溶的葡聚糖粗品。不可溶的葡聚糖可通过磷酸化、硫酸化和氨基化等方式进行衍生化修饰以提高其溶解性。可溶性葡聚糖在水溶液中主要以线形的三螺旋结构存在。研究表明，糖链的螺旋结构构象是其生物活性存在的必要条件，而糖链中的亲水性基团(多羟基)应位于螺旋体的表面〔14〕。微粒酵母葡聚糖的免疫调节活性还受其分子量和β(16)糖苷键数目的影响。同样的情况也发生在其他的一些β(13)D葡聚糖上，如真菌多糖pestalotan等。另外，支链长度也会影响多糖的活性。从真菌Phytophthoraparasitica中分离得到的活性β(13)D葡聚糖，其具有葡聚三糖支链的组份，活性大大高于具有葡聚二糖支链的组分〔16〕。

1.3 甘露聚糖从白念珠菌中分离得到了有一定免疫调节活性的甘露聚糖。巨噬细胞递呈的甘露糖结合凝集素(MBL)能与甘露聚糖结合，并通过一种非自身识别机制激活宿主免疫系统。甘露聚糖包裹感染性抗原并介导了内吞和吞噬作用，甘露聚糖受体识别多糖里的一个重复单位，这种识别导致了细胞信号转导、细胞因子产生和补体的激活。研究表明，白念珠菌甘露聚糖在皮下注射给药后对宿主的免疫抑制作用与用药后迟发型超敏反应被抑制有关〔17〕。IL4是介导甘露聚糖特异性诱导免疫下调的关键性细胞因子。另外也有研究表明，IL12p40、IL10和IFNγ对CD+T细胞(下调效应细胞)的产生也有一定作用〔18〕。

1.4 蛋白结合多糖从真菌蘑菇中分离得到了蛋白结合多糖PSK和PSP。这些化合物在结构上比较相近，分子量约为100kDa〔19〕。其单糖间以α(14)和β(13)糖苷键连接，蛋白部分则以天门冬氨酸和谷氨酸为主，蛋白含量约为15%。这类多糖能够抑制体外肿瘤细胞系的生长并具有体内的抗肿瘤活性。对食道癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和子宫颈癌等有肯定的防治效果。这类多糖的免疫调节作用机制尚不清楚。有研究表明，小鼠在PSK给药处理后，PSK能结合并抑制免疫抑制细胞因子TGFβ〔20〕。PSK还能够激活嗜中性粒细胞，这些可能是PSK抗癌活性的部分原因。PSK和PSP是生物反应调节剂，能刺激T细胞的激活和诱导IFNγ和IL2的生成。也有研究发现PSK和PSP能增强小鼠体内的超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔21〕。

1.5 透明质酸透明质酸(HA)可以由链球菌产生，同时也是组成哺乳动物组织胞外基质的一种主要的糖类成分，在皮肤、关节、眼和大多数其它的器官和组织中都有存在。透明质酸是一个二糖的重复。该二糖是一种最简单的阴离子氨基葡聚糖。透明质酸是通过与真核细胞CD44受体的结合来完成对免疫系统的调节作用。这种配体受体间的相互作用对于T细胞胞间通信和白细胞外渗的调节是至关重要的〔22〕。低分子量HA则可被用于阻断T淋巴细胞CD44和真核细胞来源HA之间的相互作用。这在临床上可被用于防止同种异体移植的排斥反应以保护机体器官的功能。另外，HA能促使创伤愈合，并能在眼睛和关节外科中被用作人体HA的替代品〔9〕。

2 抗肿瘤活性微生物

多糖的抗肿瘤活性多与其免疫调节功能密切相关。多糖能激活免疫细胞，并诱导多种免疫细胞因子和细胞因子受体基因的表达，增强机体的抗肿瘤免疫力。从担子菌门真菌中得到的香菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖、茯苓多糖等抗肿瘤多糖，在国内外临床上已普遍应用，都具有上述免疫调节剂的特征结构。从香菇子实体和深层发酵菌丝体中得到的两种具抗肿瘤活性的多糖分别为β(13)葡聚糖和含少量肽的α甘露糖。云芝多糖PSK则具有蛋白结合多糖结构。裂褶多糖和茯苓多糖也是β(13)葡聚糖，但当茯苓多糖含有β(16)葡聚糖侧链时没有活性，而用高碘酸盐氧化反应将侧链除去后，却表现出显著的抗肿瘤活性。免疫调节多糖的抗肿瘤作用需要宿主免疫系统的参与，但有些微生物多糖在体外也表现出对肿瘤细胞生长的抑制作用。除了免疫调节外，近年来对多糖抗肿瘤活性的其它作用机制也有所研究。主要有以下几个方面〔23〕：(1)影响细胞的生化代谢：茯苓多糖对肉瘤S180细胞的增殖有抑制作用，可导致S180细胞膜唾液酸(SA)含量增加，而膜磷脂、花生四烯酸和豆蔻酸的含量下降，细胞膜的PI转换被显著抑制，影响了肿瘤细胞转移和相关抗原的表达。香菇、猪苓、茯苓多糖能抑制人早幼粒细胞白血病HL60细胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)的活性，激活磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)，可降低细胞酪氨酸蛋白的磷酸化程度；(2)影响细胞周期：某些多糖可能作用于肿瘤细胞的细胞周期。Kamei等将云芝多糖与结肠癌细胞AGS一起培养4d后，肿瘤细胞的数量比对照组明显减少，流式细胞术检测表明，肿瘤细胞的生长被阻滞于S期和G2/M期〔15〕。(3)抗氧化作用：机体内过量的超氧化自由基和脂质过氧化物(LPO)对DNA的持续损伤，会导致细胞的癌变。动物和临床试验表明云芝多糖PSK能增强超氧化物歧化酶(SOD)的活性，缓解肿瘤宿主体内的氧化应激状态。Kariya等在联氨氧化反应体系中观察到云芝多糖有自由基清除剂作用，并通过电子自旋共振检测，证明其有拟SOD的作用。又有报道云芝多糖能增强正常小鼠和正常迟发型超敏感性(DH)小鼠淋巴细胞、脾及胸腺中SOD的活力，而对肿瘤组织中SOD则有明显的抑制作用。(4)其它：香菇、云芝和灵芝等多糖均能抑制鼠肝细胞对致癌物苯并芘的吸收。香菇多糖能使肿瘤部位的血管扩张和出血，造成肿瘤组织坏死。有些微生物来源的多糖与肿瘤细胞表面的糖类分子很相似，能抑制肿瘤细胞的粘附，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭与转移〔24〕。

3 抗病毒活性

多糖的抗病毒作用已引起医药界的高度重视。尤其在抗HIV方面，硫酸酯化多糖因为其活性明确，已成为近年来的研究热点〔26〕。研究表明，其作用机制除了多糖的免疫激活作用外，该类聚合物可以通过阻断HIV病毒gp120与宿主细胞CD4受体的结合而发挥作用，这可以阻断病毒对宿主细胞的吸附，防止合细胞的形成〔25〕。某些硫酸多糖还能够抑制HIV逆转录酶活性，硫酸化侧链与RNA模板引物上的某些酶有相同的结合位点，从而产生竞争性抑制作用。最近的研究又发现，硫酸多糖与HIV1反式激活因子tat的结合能阻止tat蛋白进入胞内，使HIVLTR的转录激活受到抑制，从而抑制了HIV1的复制和整合。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离子特性，因此硫酸基团是该类多糖活性的必要条件。分子中硫酸基团的含量越高，其抗HIV的作用越强。但硫酸根过多会产生抗凝血等不良反应〔27〕。硫酸基团分布的空间构象对抗病毒活性也有影响，如Tat蛋白与肝素的结合要求至少有2O、6O和N位置的硫酸化〔28〕。糖链柔性的降低能升高硫酸多糖的抗病毒活性。分子大小是多糖抗病毒活性的另一个影响因素。硫酸葡聚糖抗HIV的活性随着相对分子质量的增加而增加，相对分子质量在1×104～5×105的范围内能保持最大活性。除了抗HIV外,多糖对其他类型病毒也有抑制作用，如单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV1，HSV2)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、流感病毒(Influenza virus)、囊状胃炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等〔29〕。香菇多糖具有抗肿瘤作用，硫酸酯化后则具有显著的抗艾滋病作用，在浓度为100mg/L时能完全抑制RT活性，10～100mg/L时能抑制合体细胞的形成，10mg/L时能强烈抑制HIV抗原的合成，并能保护被HIV感染的MT4细胞。但硫酸酯化后的多糖却失去了原有的抗肿瘤活性。由此推测硫酸酯化多糖和非硫酸化多糖的免疫调节作用机制是不同的。通过13CNMR、苯胺蓝荧光法及粘度法测定证明，硫酸基团的引入造成多糖理化性质及其空间立体构象的变化，而这正是多糖活性的决定因素。

4 其它活性

多糖的免疫调节功能使其在临床上具有抗感染和抗炎活性。免疫调节剂的使用相对于常规药物治疗具有其独特的优点。对宿主免疫系统的先天抗感染能力的增强可能会有效地解决抗生素耐药的问题。吴倩等应用重组sIL1 RⅠ为靶点建立抑制剂筛选模型，从链霉菌的代谢产物中得到IL1的拮抗剂139A，动物模型的研究表明它们具有抗类风湿性关节炎的作用〔30〕。对139A生物合成中引导糖基转移酶基因的克隆和鉴定工作也已经完成〔31〕。对中药植物多糖降血糖活性的研究较为普遍，近年来，从微生物中也发现了一些有明显降血糖作用的多糖。从Cordyccps sinensis中提取得到的多糖CSF10能增强葡萄糖激酶活性，加速葡萄糖的代谢；并可以降低GLUT2蛋白水平从而抑制肝脏葡萄糖的输出，最终达到降低血糖的目的〔32〕。另外，发现某些微生物来源多糖(如银耳多糖)和一些多糖的硫酸化衍生物，具有肝素样抗凝血作用，其抗凝活性与多糖分子量和硫酸化程度相关；木耳多糖、银耳多糖等对血栓的形成有抑制作用，这可能与它们降低血栓纤维蛋白原含量，降低血小板数目及其粘附力的能力有关；香菇多糖可促进胆固醇代谢而降低血清胆固醇含量，从而达到降血脂的目的；灵芝多糖能抑制人嗜中性粒细胞自发和Fas介导的细胞凋亡，这与抗衰老活性相关；灵芝中的一种小分子多糖能增加蛋白和核酸的合成；而某些微生物多糖对RNase有抑制作用，可减少RNA降解，对RNA治疗可起到协同作用。5 结语

多糖类药物具有多效性、低毒性、来源广泛、天然绿色等优点，多糖与现有药物的联合用药可以提高药物的作用范围和效力，减少用药量，并可防止或推迟耐药的出现。但由于多糖结构太复杂，所以不易控制其质量标准，结构测定及合成难度较大；缺乏明确的作用机制研究；而有些多糖在天然产物中含量很低且不易分离得到。这使它们在临床上的应用受到限制。近年来，随着结构分析技术的进步和作用机制研究的不断积累和深入，人们对多糖如何作用于细胞因子网络、协调生物学功能的结构特征有了更多的了解，发现了一些多糖的特异受体，为新活性化合物的开发提供了基础。对于多糖构效关系的认识也更为丰富，为提高活性而进行的结构改造工作也有很大进展。多糖的结构研究是多糖研究中亟待解决的薄弱环节。在确保多糖纯度的前提下，现有二维核磁技术的结合(如：COSY谱、NOESY谱、HOHAHA谱、TOCSY谱等)使我们有可能推导出部分多糖完整的一级结构〔33〕。而质谱由于其高度的灵敏性，在多糖尤其是极少量多糖的结构分析中，也发挥了越来越重要的作用，FABMS和液质联用技术已越来越广泛地用于多糖的结构分析中。多糖的高级结构分析也有所发展，但还无法做到像核酸和蛋白质结构测定那样自动化、微量化和标准化。关于药用微生物多糖生物合成的研究也逐渐开展起来。对这些微生物菌株进行的多糖合成基因分析发现有共同的操作子结构，暗示了这些多糖的生物合成拥有相同的分子机制。对于多糖合成基因簇及其生物合成途径更深入的了解，能为进一步的组合生物学研究，以及最终获得新结构多糖、改变天然多糖理化性质、提高多糖的活性和产量提供理论基础。

参考文献

〔1〕 Kasper D L, Onderdonk A B, Crabb J, et al. Protective efficacy of immunization with capsular antigen against experimental infection with Bacteroides fragilis 〔J〕. J Infect Dis,1979,140:724

〔2〕 Tzianabos A O, Russell P R, Onderdonk A B, et al. IL2 mediates protection against abscess formation in an experimental model of sepsis 〔J〕. J Immunol,1999,163:893

〔3〕 Tzianabos A O, Onderdonk A B, Rosner B, et al. Structural features of polysaccharides that induce intraabdominal abscesses 〔J〕. Science,1993,262:416

〔4〕 Tzianabos A O, Kasper D L, Cisneros R L, et al. Polysaccharidemediated protection against abscess formation in experimental intraabdominal sepsis 〔J〕. J Clin,1995,96:2727

〔5〕 Williams D L, Sherwood E R, Browder I W. Effect of glucan on neutrophil dynamics and immune function in Escherichia coli peritonitis 〔J〕. J Surg Res,1988,44:54

〔6〕 Cleary J A, Kelly G E, Husband A J. The effect of molecular weight and beta1,6linkages on priming of macrophage function in mice by (1,3)betaDglucan 〔J〕. Immunol Cell Biol,1999,77:395

〔7〕 Soltys J, Quinn M T. Modulation of endotoxin and enterotoxininduced cytokine release by in vivo treatment with beta(1,6)branched beta(1,3)glucan 〔J〕. Infect Immun,1999,67:244

〔8〕 Wakshull E, BrunkeReese D, Lindermuth J, et al. PGGglucan, a soluble beta(1,3)glucan, enhances the oxidative burst response, microbicidal activity, and activates an NFkappa Blike factor in human PMN: evidence for a glycosphingolipid beta(1,3)glucan receptor 〔J〕. Immunopharmacology,1999,41:89

〔9〕 Tzianabos O. Polysaccharide immunomodulators therapeutic agents: structural aspects and biologic function 〔J〕. Tzianabos,2005,13(4):523

〔10〕 Williams A, Sun X, Fischer J E, et al. The expression of genes in the ubiquitinproteasome proteolytic pathway is increased in skeletal muscle from patients with cancer 〔J〕. Surgery,1999,126:744

〔11〕 Muller A, Rice P J, Ensley H E, et al. Receptor binding and internalization of a watersoluble (13)βglucan biologic response modifier in two monocyte/macrophage cell lines 〔J〕. J Immunol,1996,156:3418

〔12〕 Yan J, Vetvicka V, Xia Y, et al. Betaglucan, a "specific" biologic response modifier that uses antibodies to target tumors for cytotoxic recognition by leukocyte complement receptor type 3(CD11b/CD18) 〔J〕. J Immunol,1999,163:3045

〔13〕 Wakshull E, BrunkeReese D, Lindermuth J, et al. PGGglucan, a soluble beta(1,3)glucan, enhances the oxidative burst response, microbicidal activity, and activates an NFkappa Blike factor in human PMN: evidence for a glycosphingolipid beta(1,3)glucan receptor 〔J〕. Immunopharmacology,1999,41:89

〔14〕 Kulicake W M. Correlation between immunological activity, molar mass, and molecular structure of different (1→3)βDglucans 〔J〕. Carbohydr Res,1997,297:135

〔15〕 Lin X, Cai Y J, Li Z X, et al. Structure determination, apoptosis induction, and telomerase inhibition of CFP2, a novel lichenin from Cladonia furcata 〔J〕. Biochim Biophys Acta,2003,1622:99

〔16〕 Perret J, Bruneteau M, Micheal G, et al. Effect of growth conditions on the structure of βDglucans from Phytophthoraparasitica dastur, aphytophthogenicfungus 〔J〕. Carbohydr Polymer,1991,17(2):231

〔17〕 Garner R E, Childress A M, Human L G, et al. Characterization of Candida albicans mannaninduced, mannanspecific delayedhypersensitivity suppressor cells 〔J〕. Infect Immun,1990,58:2613

〔18〕 Wang Y, Li S P, Moser S A, et al. Cytokine involvement in immunomodulatory activity affected by Candida albicans mannan 〔J〕. Infect Immun,1998,66:1384

〔19〕 Ng T B. A review of research on the proteinbound polysaccharide (polysaccharopeptide, PSP) from the mushroom Coriolus versicolor (Basidiomycetes: Polyporaceae) 〔J〕. Gen Pharmacol,1998,30:1

〔20〕 Matsunaga K, Hosokawa A, Oohara M, et al. Direct action of a proteinbound polysaccharide, PSK, on transforming growth factorbeta 〔J〕. Immunopharmacology,1998,40:219

〔21〕 Wei W S, Tan J Q, Guo F, et al. Effects of Coriolus versicolor polysaccharides on superoxide dismutase activities in mice 〔J〕. Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao,1996,17:174

〔22〕 Siegelman M H, DeGrendele H C, Estess P. Activation and interaction of CD44 and hyaluronan in immunological systems 〔J〕. Leukoc Biol,1999,66:315

〔23〕 周永. 多糖类抗肿瘤作用的研究进展〔J〕. 国外医学卫生学分册，2001，28(3)

〔24〕 Katsuhide M, Shin Y, Yuji K, et al. Activity of microbial surface polysaccharides in inhibition of cancer cell adhesion 〔J〕. Kagaku Kogaku,1996,60(11):832

〔25〕 Callahan L N, Phelan M, Mallinson M, et al. Dextran sulfate blocks antibody binding to the principal neutralizing domain of human immunodeficiency virus typeⅠ without interfering with gp120CD4 interaction 〔J〕. J Virol,1991,65(3):1543

〔26〕 Berteau O, Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide 〔J〕. Glycobiology,2003,13(6):29R

〔27〕 Yoshida O, Nakashima H, Yoshida T, et al. Sulfation of the immunomodulating polysaccharide lentinan: a novel strategy for antivirals to human immunodeficiency virus (HIV) 〔J〕. Biochem Pharmacal,1998,37(15):2887

〔28〕 Watson K, Gooderham N J, Davies D S, et al. Interaction of the transactivating protein HIV1 Tat with sulphated polysaccharide 〔J〕. J Infect Dis,1990,161(1):208

〔29〕 王长云，管华诗. 多糖抗病毒作用研究进展Ⅰ多糖抗病毒作用〔J〕. 生物工程进展，2000，20(1)：17

〔30〕 吴倩，吴剑波，李元. 白细胞介素1受体拮抗剂139A的理化性质及体内活性研究〔J〕. 中国抗生素杂志，1999，24(6)：401

〔31〕 王玲燕，李元，等. 链霉菌胞外多糖139A生物合成中引导糖基转移酶基因的克隆和鉴定〔J〕. 遗产学报，2003，30(8)：723

〔32〕 Kiho T, Ookubo K, Usui S, et al. Structrual features and hypoglycemic activity of a polysaccharide (CSF10) from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis 〔J〕. Biol Pharm Bull,1999,22(9):966

〔33〕 Sandeep S, Glushka J, Halbeek H, et al. Structure of the capsular polysaccharide of clostridium perfringers hobbs 5 as determined by NMR spectroscopy 〔J〕. Carbohydr Res,1997,299:119

DSS适合的浓度是一个区间范围值，以往文献在2%-5%之间多；

建议第一次做实验的时候建议3%，一个循环后看情况＋或-0.5%。

同时建议在正式实验开始前做预实验来确定实际诱导浓度。

不同批次的DSS使用浓度会有差异：

DSS是葡聚糖聚合物，分子量是平均分子量，每个批次之间会有分子量的差异，而分子量对肠炎造模有影响。通常DSS批间差比较稳定，但是也有少部分批次存在批间差较大的现象，建议客户根据自己实验需求，购买足够的同一批次产品。

诱导急性结肠炎模型的Protocol：选取成年动物正常饲养1-2周→2-5%DSS自由饮5-7天观察症状体征。

诱导慢性结肠炎模型的Protocol：选取成年动物正常饲养1-2周→2-3%DSS自由饮5-7天观察症状体征→停止饮用DSS，改正常饮水7-14天→重复2-3%DSS自由饮5-7天观察症状体征→重复停止饮用DSS，改正常饮水7-14天。

ZHAO Ping, DONG Lei, LUO Jin�Yan, MA Hui, GUAN Hai�Tao, SHANG He�Ling

1Department of Gastroenterology, 2Department of Oncosurgery, Second Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China, 3Tangyu Convalescent Hospital, Lantian 710516, China

【Abstract】 AIM: To establish the rat model of ulcerative colitis (UC). METHODS: The rats were first given 40 g/L dextran sulfate sodium (DSS) in drinking water for 7 d and then given only water for 10 d. The disease activity index (DAI) of all the rats was evaluated daily. The rats were killed on day 8, 13 and 18 and the lesion score and histological score of colon were evaluated. Segments of distal colon were adequately prepared for transmission electron microscopic observations. The weight index of cecum, colon, thymus and spleen were calculated and the myeloperoxidase (MPO) activity of rectum was measured. RESULTS: Rats receiving 40 g/L DSS solution for 7 d developed diarrhea and positive fecal occult blood. Inflammation of colon mainly involved the mucous membrane and submucosa. Focal erosions of the epithelium, goblet cells depletion, destruction of crypt and neutrophil infiltration were observed. The increase of MPO activity 〔(8.84±3.67) nkat/g tissue vs (127.19±27.84) nkat/g tissue, P<0.01〕 and weight of spleen 〔(3.45±1.00) mg/g vs (5.07±1.31) mg/g, P<0.05〕 was also observed. After replacing the DSS solution with water, the symptoms and colonic pathological changes of rats were gradually disappeared and the MPO activity significantly decreased（P<0.05）. CONCLUSION: This colitis model in rats appears to share nearly all the morphological characteristics with human UC.

【Keywords】 disease models, animalcolitis, ulcerativedextra sulfate sodium

【摘要】 目的: 建立大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型. 方法： 给SD大鼠饮用40 g/L DSS溶液7 d，然后改正常饮水10 d. 每日进行疾病活动指数(DAI)评分. 于实验8,13和18 d分别处死4～5只，行组织学大体评分、组织病理评分及透射电镜观察. 计算盲肠、回盲部至肛门段结肠、胸腺、脾脏质量指数并测直肠髓过氧化物酶（MPO）含量. 结果：大鼠饮用40 g/L的DSS 7 d均出现腹泻、隐血试验阳性. 可见炎症主要累及黏膜和黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主. 伴有MPO升高〔(8.84±3.67) nkat/g vs (127.19±27.84) nkat/g, P<0.01〕及脾脏增大〔(3.45±1.00) mg/g vs (5.07±1.31) mg/g, P<0.05〕. 停药后症状及结肠病变逐渐恢复， MPO活性显著降低（P<0.05）. 结论：此模型病理改变类似人UC.

【关键词】 疾病模型，动物；结肠炎，溃疡性；葡聚糖硫酸钠

0引言

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）在我国的发病率逐渐增高. 其确切的病因和发病机制至今尚不完全清楚,缺乏有效的根治方法. 因此建立UC动物模型,对研究UC的病因、病理机制及新药开发具有重要意义. 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC动物模型与人类UC的病理形态极为近似，但不同物种及不同浓度DSS所诱导的UC的病变特征不同. 我们选用SD大鼠建立UC动物模型，并观察该模型不同时期的症状、病理等改变如下.

1材料和方法

1.1材料

健康雄性SD大鼠26只，体质量180～200 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 葡聚糖硫酸钠Sigma公司生产,Mr 5000,硫磺含量150～200 g/kg. 髓过氧化物酶（myeloperoxidas，MPO）检测试剂盒购自南京建成生物研究所. H�600透射式电子显微镜由日本日立公司生产.

1.2方法

大鼠随机分为DSS模型组（n=20）和正常对照组（n=5），DSS模型组饮用40 g/L DSS溶液7 d诱发急性结肠炎,然后改正常饮水10 d. 正常对照组大鼠正常饮水. DSS模型组每日记录大鼠体质量、大便性状、隐性或显性出血情况, 进行疾病活动指数(DAI)评分〔1〕. 于实验8（n=5）, 13（n=5）和18 d（n=4）用200 g/L乌拉坦7 mL/kg ip麻醉，剖腹观察结肠外观，延系膜侧剖开结肠，行组织学大体评分〔2〕. 取盲肠、回盲部至肛门段结肠、胸腺、脾脏称质量，计算体质量指数. 取升结肠、横结肠、远段结肠各1.5 cm,用40 g/L甲醛溶液固定,切片,HE染色，行组织病理评分〔3〕. 取距肛门3 cm处直肠黏膜行透射电镜观察. 称取直肠黏膜100 mg，-80℃保存，按MPO试剂盒说明进行检测.

统计学处理： 使用SPSS 10.0软件行统计学处理. 数据以x±s表示，采用One�way ANOVA分析. P<0.05为差异有显著性.

2结果

大鼠饮用40 g/L DSS 3~7 d出现急性结肠炎症状，腹泻、隐血试验阳性最早于3 d出现，肉眼血便最早于4 d出现. 动物体质量明显下降， 5 d除血便极轻的2只大鼠体质量稍增加和1只大鼠明显增加外，其余17只体质量仍减轻. 饮用DSS过程中大鼠出现毛发色泽灰暗,精神萎靡,食量下降等. 停药后1～2 d，腹泻、血便迅速好转. 模型组DAI值由2 d的0.56±0.41迅速升至7 d的2.04±0.77，差异有显著性（P<0.01）. 7～9 d死亡6只，1只死于肠坏死，1只死于衰竭，4只死于肠道出血. 实验8 d见大肠缩短，肠壁明显增厚,管壁僵硬，肠黏膜广泛充血、水肿，局部有糜烂、出血，可见明显溃疡面. 病变以回盲部及远段结肠为重. 远段结肠的不规则溃疡及糜烂多见于距肛门缘3～4 cm内,病变自下向上逐渐减轻. 实验13 d，结肠病变有所恢复，仍有局部充血、水肿和溃疡. 实验18 d，结肠病变基本恢复，溃疡愈合，仍有局部充血、水肿，结肠损伤评分较8 d显著减低（P<0.01,Tab 1）.表1DSS所致结肠炎恢复过程中结肠损伤及组织损伤评分（略）

2.1组织病理改变实验8 d越近肛门侧病理改变越明显，与肉眼观察一致. 光镜下可见炎症主要累及黏膜、黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主,符合急性炎症的组织病理改变（Fig 1A）. 实验13 d，光镜下可见较局限的隐窝破坏伴上皮再生修复及腺体增生，隐窝变形、排列紊乱. 实验18 d，黏膜基本恢复正常，仍有少量炎细胞浸润. 升结肠、横结肠组织损伤评分各时间段差异无显著性(Tab 1). 电镜观察发现正常对照组结肠上皮细胞微绒毛完整，细胞连接和细胞器未见损伤，杯状细胞分泌旺盛. DSS模型组结肠上皮细胞有坏死脱落，细胞受损严重，表现为微绒毛稀疏、紊乱、断裂乃至脱落，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，核染色体边集明显. 杯状细胞明显减少，残留的杯状细胞水肿明显，线粒体肿胀、嵴突减少、嵴断裂，内质网扩张（Fig 1B）.

2.2脏器体质量指数和MPO活性改变实验7 d后，盲肠、结肠、脾脏体质量指数显著增加，停药后逐渐恢复（Tab 2）. 在DSS致大鼠急性肠炎过程中胸腺体质量指数无明显变化. 实验7 d后，MPO活性显著升高，停药5 d后显著降低（Tab 2）.表2DSS结肠炎恢复过程中脏器体质量指数及MPO活性（略）

3讨论

大鼠饮用40 g/L DSS 7 d均出现急性结肠炎症状，腹泻、隐血试验阳性最早于3 d出现，肉眼血便最早于4 d出现. 大体观察见肠壁明显增厚，管壁僵硬，肠黏膜广泛充血、水肿，局部有糜烂、出血，可见明显溃 疡面. 病变以盲肠及远段结肠为重. 光镜下可见炎症主要累及黏膜、黏膜下层，部分表面上皮脱落，上皮内杯状细胞减少，隐窝破坏，浸润的炎症细胞以中性粒细胞为主,符合急性炎症的组织病理改变. 这些改变与人类的UC相似〔1,2〕. DSS致大鼠UC模型简便易行，让实验动物自由饮用DSS配成水溶液即可，重复性好,成模率达100%，成功率高. 以往研究表明，人为反复运用DSS刺激，可诱导大鼠出现类似人类的急性期和缓解期交替出现的变化，与人类病变、病程相似〔1〕. 因此，DSS致大鼠UC模型是较为成功的UC动物模型. 我们观察到单次给DSS，停药后结肠病变逐渐好转，至停药后10 d，结肠病变基本恢复，溃疡愈合，仅有局部充血、水肿. 故如应用该模型进行药物干预治疗，应注意治疗时机的选择.

DSS诱导大鼠结肠炎模型与人类UC的症状及病理改变均相似. 该模型制作简单、重复性好，除可用于UC发病机制的研究外，还可用于开发新型UC治疗药物的研究，如黏膜保护剂、抗TNF抗体〔3,4〕等有潜在治疗作用的药物.

【参考文献】

〔1〕 Osman N, Adawi D, Ahrne S, et al. Modulation of the effect of dextran sulfate sodium�induced acute colitis by the administration of different probiotic strains of Lactobacillus and Bifidobacterium〔J〕. Dig Dis Sci, 200449(2):320-327.

〔2〕 Luk HH, Ko JK, Fung HS, et al. Delineation of the protective action of zinc sulfate on ulcerative colitis in rats〔J〕. Eur J Pharmacol, 2002443(1�3): 197-204.

〔3〕 Iba Y, Sugimoto Y, Kamei C, et al. Possible role of mucosal mast cells in the recovery process of colitis induced by dextran sulfate sodium in rats 〔J〕. Int Immunopharmacol, 20033(4): 485-491.

〔4〕 Murakami A, Hayashi R, Takana T, et al. Suppression of dextran sodium sulfate�induced colitis in mice by zerumbone, a subtropical ginger sesquiterpene, and nimesulide: Separately and in combination 〔J〕. Biochem Pharmacol, 200366(7): 1253-1261.

一、直观：评估其疾病活动指数（DAI），1体重下降百分值 2大便松散/稀便 3大便隐血/肉眼血便

二、组织：评估其组织学损伤指数（HI），DSS造模期间可以进行不同时间点的检测，观察DSS饮用前期一般2天造成上皮屏障破坏，可以选择第3天、第5天、第7天 进行病理检测。粘膜损伤程度 和 粘膜损伤范围，是否有隐窝腺体丢失，黏膜损伤，上皮溃烂、伴有明显的炎性细胞浸润。

如果造模的目的是做药物治疗实验，根据客户以往的经验，通常是先做预实验，观察动物从哪一天开始体重下降；之后在DSS引用后固定的天数给药。譬如，在DSS喂食后第二或三天即开始给药。