DNA抽提过程中为什么要加入醋酸钠

观察DNA和RNA在细胞中的分布，乙酸和乙酸钠用来配制吡罗红甲基绿混合染色剂。

染色剂的配制

①染色剂A液的两种配制方法

第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1 g，加入到100 mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。

第二种方法：取甲基绿2 g溶于98 mL蒸馏水中，取吡罗红G 5 g溶于95 mL蒸馏水中。取6 mL甲基绿溶液和2 mL吡罗红溶液加入到16 mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）

②染色剂B液的配制方法 B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解至1 000 mL备用；再取乙酸12 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL备用。取配好的乙酸钠溶液30 mL和稀释的乙酸20 mL，加蒸馏水50 mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。

③染色剂的配制 染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20 mL和B液80 mL混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现用现配。

利用甲基绿、吡罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。答复：试剂及配制方法（1）试剂 质量分数为0.9%的NaCl溶液，质量分数为8%的盐酸，乙酸钠，乙酸，蒸馏水，吡罗红甲基绿混装粉。如果化学试剂商店没有吡罗红甲基绿混装粉，可以分别购买甲基绿和吡罗红G，然后按A液的第二种方法配制（见下文）。（2）染色剂的配制①染色剂A液的两种配制方法第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1 g，加入到100 mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。第二种方法：取甲基绿2 g溶于98 mL蒸馏水中，取吡罗红G 5 g溶于95 mL蒸馏水中。取6 mL甲基绿溶液和2 mL吡罗红溶液加入到16 mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）②染色剂B液的配制方法 B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解至1 000 mL备用；再取乙酸12 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL备用。取配好的乙酸钠溶液30 mL和稀释的乙酸20 mL，加蒸馏水50 mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。③染色剂的配制 染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20 mL和B液80 mL混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现用现配。

龙胆紫或醋酸洋红

还有碱性染料或改良苯酚品红溶液

DNA染色实验

1、原理与解析

(1)真核细胞的DNA主要分布在细胞核内,RNA主要分布在细胞质中.

(2)甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同,甲基绿对DNA亲和力强,使DNA显现出绿色,而吡罗红对RNA的亲和力强,使RNA呈现出红色.用甲基绿、吡罗红的混合染色剂将细胞染色,可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布.(同时甲基绿用二苯胺或龙胆紫代替做平行)

(3)盐酸的作用

① 盐酸能改变细胞膜的通透性,加速染色剂的跨膜运输；

② 盐酸使染色体中的DNA与蛋白质分离,便于DNA与染色剂的结合.

注意事项

1.材料的选择

① 选用的实验材料既要容易获得,又要便于观察；

② 常用的观察材料由人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰,不可使用紫色表皮细胞)

2.取材要点

① 取口腔上皮细胞之前,应先漱口,以避免装片中出现太多的杂质；

② 取洋葱表皮细胞时,尽量避免材料上带有叶肉组织细胞.

3.冲洗载玻片时水的流速要尽量慢,切忌直接用水龙头冲洗.

4.安全要点

① 用酒精灯烘烤载玻片时,不要只集中于材料处,而应将载玻片在火焰上来回移动,使载玻片均匀受热,以免破裂；

② 烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中,最好先自然冷却1分钟.

5.换用高倍镜观察材料时,只能用细准焦螺旋进行调焦,切不可动粗准焦螺旋.

主要步骤(以观察口腔上皮细胞为例)

1.取材

① 滴： 在洁净的载玻片上滴一滴质量分数为0.9%的NaCl溶液；

② 刮： 用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻地刮几下；

③ 涂： 将牙签上的碎屑涂抹在载玻片的生理盐水中；

④ 烘： 将涂有口腔上皮细胞的载玻片在酒精灯的火焰上烘干.

2.水解

① 将烘干的载玻片放入装有30ml质量分数为8%的盐酸的小烧杯中,进行材料的水解；

② 保： 将小烧杯放入装有30℃温水的大烧杯中保温5分钟.

3.冲洗涂片

① 冲： 用缓缓的蒸馏水冲洗载玻片10秒钟；

② 吸： 用吸水纸吸去载玻片上的水分.

4.染色

① 染：用2滴吡罗红甲基绿混合染色剂滴在载玻片上,染色5分钟；

② 吸： 吸去多余染色剂；

③ 盖： 盖上盖玻片.

5.观察

① 低： 在低倍物镜下,寻找染色均匀,色泽浅的区域,移至视野中央,将物像调节清晰；

② 高： 转到高倍物镜,调节细准焦螺旋,观察细胞核和细胞质的染色情况.

2%甲基绿水溶液的配制

甲基绿（methyl green） 蒸馏水加至 50mlc 用三氯甲烷抽提, 甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末,属三苯甲烷染料,这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一 种化合物.由于甲基化作用,甲基绿就比甲基绿后,所引进的甲基连接得并不牢固,容易从甲基绿中脱失.另一方面, 在甲基化过程中,还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿,因此,也有人认为甲中,常有少量的甲基紫或结晶紫成份.但是,也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物,甲基绿在储存过程中,会不断产生甲基紫.因此,在配制试剂时,必须 先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来,才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色.抽提方法是取 2%甲基绿水溶 液 20ml 倾入洁净分液漏斗,加入三氯甲烷 20ml 充分摇荡混合,使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色.旋动分液 漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反复更换三氯甲烷,直到三氯甲烷无紫红色为止,即可得到得纯的甲基绿溶液.

英文名称：Methyl Green 分子式：C27H35Cl4N3Zn 分子量：608.78 IUPAC 名称： 4-((4-(dimethylamino)phenyl)(4-(dimethyliminio)cyclohexa-2,5-dieny lidene)methyl)-N-ethyl-N,N-dimethylbenzenaminium dichloride compound with zinc(II) chloride 甲基绿是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末.溶于水,显蓝绿色. 稍溶于乙醇,不溶于戊醇. 盐酸中显红黄色,在氢氧化钠中无色.试剂溶液在可见光区有吸收峰 (λmax=633.8nm). 与 ReO4-、HgCl42-、BiI4-、AuCl4-和 GaCl4-等形成离子缔合物. 用于光度法测定 Hg2+、ReO4-等,定性检出铁氰化物,酸碱指示剂和细 胞染色剂.

甲基绿为碱性染料,它易与聚合程度高的 DNA 结合呈现绿色. 又称双绿 SF 双绿 SF.绿色晶体,具金黄色光泽,或淡绿色粉末.溶于水,呈蓝 绿色.微溶于乙醇,不溶于乙醚. 由氯甲烷与甲基紫(C.I.碱性紫 1)反应制得. 商品通常为锌复盐 C26H33N3Cl2ZnCl2(称 C.I.碱性蓝 20). 用于细菌染色(新鲜标本细胞核染色)甲基绿-盐酸混合物用于检定精子、 淋球菌和肥大细胞染色. 甲基绿可用于鉴定 DNA.DNA 遇甲基绿（常温）会被染成蓝绿色. 甲基绿—派洛宁 （methyl green-pyronin）为碱性染料,它分别能与细胞内的 DNA、RNA 结合呈现不同颜色.当甲基绿与派洛宁作为混合染料时,甲基绿与染色质中 DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的 RNA 选择性结 合显示红色.其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用,同时两种核 酸分子都是多聚体,而其聚合程度有所不同.

甲基绿易与聚合程度高的 DNA 结合呈现绿色.而派洛宁则与聚合程度较低的 RNA 结合呈现红色（但解聚的 DNA 也能和派洛宁结合呈现红色）.即 RNA 对派洛宁亲和力大,被染成红色, 而 DNA 对甲基绿亲和力大,被染成绿色.

使用配制方法 关于吡罗红和甲基绿分装粉的使用方法 试剂及配制方法（ 1） 试剂 ） 质量分数为 0.9%的 NaCl 溶液,质量分数为 8%的盐酸,乙酸钠,乙酸, 蒸馏水,吡罗红甲基绿混装粉.如果化学试剂商店没有吡罗红甲基绿混装粉, 可以分别购买甲基绿和吡罗红 G,然后按 A 液的第二种方法配制（见下文）.（ 2） 染色剂的配制 ） ①染色剂 A 液的两种配制方法 第一种方法：取吡罗红甲基绿粉 1 g,加入到 100 mL 蒸馏水中溶解,然 后用滤纸过滤,将滤液放入棕色瓶中备用. 第二种方法：取甲基绿 2 g 溶于 98 mL 蒸馏水中,取吡罗红 G 5 g 溶于 95 mL 蒸馏水中.取 6 mL 甲基绿溶液和 2 mL 吡罗红溶液加入到 16 mL 蒸馏 水中,即为 A 液,放入棕色瓶中备用.（注意：用于核酸染色的是吡罗红 G, 请不要错买吡罗红 B.） ②染色剂 B 液的配制方法 B 液是一种缓冲液, 由乙酸钠和乙酸混合而成. 先取乙酸钠 16.4 g,用蒸馏水溶解至 1 000 mL 备用；再取乙酸 12 mL,用蒸 馏水稀释至 1 000 mL 备用.取配好的乙酸钠溶液 30 mL 和稀释的乙酸 20 mL, 加蒸馏水 50 mL,配成 pH 为 4.8 的 B 液（缓冲液）. ③染色剂的配制 染色剂是由 A 液、B 液混合配制而成的.取 A 液 20 mL 和 B 液 80 mL 混合,就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂.应该注意的是 该试剂应现配现用

乙醇沉淀DNA的原理是当乙醇比例大于60%时，乙醇和DNA竞争性的争夺水分子，破坏了核酸表面的水膜，使核酸沉淀下来。所以你加了1ml的乙酸钠－EDTA后，总的水体积变了，然后你再按原体积加2倍体积的原乙醇，乙醇的比例不够自然不会有沉淀。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。

我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。

生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。

每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。

每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当 SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2 M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的 NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。用 25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。

得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。