苯酚硫酸法是什么？
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。
1、制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。
摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2、取多糖样品1.0ml，加1.0ml蒸馏水，然后加入6%苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。
注意
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
1． 浓硫酸：分析纯，95.5%
2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）
4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸
在单因素试验基础上,选择对多糖含量测定结果产生显著影响的4个显色因素:6％苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度、水浴显色时间进行正交试验,获得传统苯酚-硫酸法测定多糖含量的最佳显色条件是1 mL 6％苯酚溶液、7 mL浓硫酸、4℃反应温度、30 min水浴显色.改进后的多糖含量测定的显色条件即按照1:7的比例直接配制苯酚-硫酸显色液,在4℃条件下加入样品溶液,在90℃水浴进行30 min显色后,于490 nm处测定吸光度,计算多糖含量.通过传统最佳显色方法的验证试验和改进后的显色方法测定多糖含量的结果比较,表明改进后的方法具有操作简便、精密度高、准确度高、实用性强的优势.
磺化反应：苯分子等芳香烃化合物里的氢原子被硫酸分子里的磺酸基（—SO3H）所取代的反应。
磺化反应过程
一种向有机分子中引入磺酸基(—SO3H)或磺酰氯基(—SO2Cl)的反应过程。磺化过程中磺酸基取代碳原子上的氢称为直接磺化；磺酸基取代碳原子上的卤素或硝基，称为间接磺化。 磺化剂 通常用浓硫酸或发烟硫酸作为磺化剂，有时也用三氧化硫、氯磺酸、二氧化硫加氯气、二氧化硫加氧以及亚硫酸钠等作为磺化剂。
利用多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490 nm 处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系。
