DNA怎么提取

我是做动物的，没有提过植物的DNA，对β-巯基乙醇也只在提蛋白的时候用过。

百度知道里有这么一句：“用CTAB法提取某些易发生褐变物种的DNA时不加肯定会对细胞产生影响，但具体会有何影响则视具体物种，操作环境和具体方法的不同而定”。虽然百度知道的可信性有点...不过物种不同所以效果不同也的确是普遍存在的现象。

我做实验的感觉是，东西做出来是王道，现成的protocol只是参考。比如我自己提蛋白用的裂解液的配方是自己摸出来的，跟其他人和文献上都不一样。如果你们实验室这种提取方法提取出的DNA质量的确好，并且是可重复的，那就这么做好了。机理细节，也许就是物种特异性、氧化性不强，也有可能是你们用的这一批巯基乙醇质量一般，或者混入了其他东西。如果想要验证，可以再买另一个公司的试试，当然如果只focus在DNA上，并且现在已经很好了，就这么做下去也不妨。不是不求甚解，而是主次有别。

植物学门外汉，一家之言，仅供参考。祝实验顺利=)

百度知道有这么一句话：“用CTAB法提取的DNA时，不褐变有些品种易发生细胞会产生一定的影响，但它依赖于特定物种的具体影响，以及特定的操作环境不同的方法而定。

“虽然百度知道一点点......但不同物种的信誉是不同的，效果确实是一个普遍的现象。

我做实验的感觉是，事情做好才是王道，准备协议仅供参考。例如，我有使用自己的脱节，与人民和其他文献中不一样的提食谱裂解液的蛋白质。如果你的这个实验室提取方法提取的DNA的质量确实不错，是可重复的，那么这样的工作。该机制的细节，或许物种特异性，氧化性不强，它也有可能是一些一般性质量你巯基乙醇的使用，或与其他的东西混合。如果您想验证，可以尝试购买另一家公司，当然，如果仅仅着眼于DNA，现在已经很不错了，你也不妨继续这样做。不是一个肤浅的认识，但也有其他的小学和中学。

植物学门外汉，一家之言，仅供参考。我希望实验成功=）

第一种方法是测量260/280的比例，判断是否有蛋白质的污染。在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.75-1.80之间。低于此值表明制备物中残留蛋白质成分较高或含有酚，高于此值表明有RNA的残留。

第二种方法是凝胶电泳分析，看有无断裂降解。

影响DNA提取质量的因素：

如果实验开始植物样品不经液氮处理，则提取液中的CTAB浓度需要提高到4%。

在大多数情况下，使用0.1%巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用。但这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%，则会大大降低DNA提取的得率。

扩展资料：

DNA的提取方法：

一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

二、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

五、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

七、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

参考资料来源：百度百科-DNA提取

CTAB

(hexadecyltrimethylammonium

bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L

NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注:CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方:

Tris-HCl

(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性

NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中

CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方:

(1)

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染同时它也能和多糖结合，有效去除多糖

(2)

蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化

(3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M

NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500

μL

DNA液中加入200μl

20%

PEG8000

(含1.2

M

NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化

(4)

多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

(5)

盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题

DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策:重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。

(1)DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题:材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

(2)DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。

细胞膜

质体

线粒体

叶绿体

剩下细胞核了。就是DNA了。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl

ammomum

bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium

dodecyl

sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液