DNA可以硫酸化么

一 教学目的

1.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。

2.观察提取出来的DNA物质。

二 教学建议

在本实验的教学中，教师应注意以下几点。

1.实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。

2.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。

3.获取较纯净的DNA的关键步骤。

(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。

(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。

(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。

三 参考资料

实验原理的补充介绍

1.DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。

2.将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。

3.DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。

4.DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。

5.DNA的沉淀和浓缩 除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。

6.DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。

鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。

二苯胺试剂的配制

A液： 15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。

2、 pH影响：般缓冲液pH调节7.4-7.8较用7.8实验表明若pH7.5-8.0酶力定100%体系偏碱（pH8.3）仅全部力65%；体系偏酸（PH6.9）仅全部力40%

3、 ATP浓度影响：连接缓冲液ATP浓度0.5-4mmol/L间较用1mmol/L研究发现ATP适浓度0.5-1mmol /L浓抑制反应例5mmol/LATP完全抑制平末端连接黏端连接10%抑制；报道ATP浓度0.1mmol/L 磷酸载体自环比例由于ATP极易解所连接反应失败除DNA与酶问题外应考虑ATP素含ATP缓冲液应于 -20℃保存溶化取用立即放连接缓冲液体积较管贮存防止反复冻融引起ATP解与限制酶缓冲液同含ATP连接缓冲液 期放置往往失效所自行配制含ATP缓冲液（期保存）临用加入新配制ATP母液

4、 连接温度与间影响：黏性末端DNA双链间氢键作用所温度高使氢键稳定连接酶适温度恰37℃解决矛盾经 综合考虑传统连接温度定16℃间4-16h现经实验发现于般黏性末端说20℃ 30min足取相连接效间充裕20℃ 60min能使连接反应进行更完全些于平末端用考虑氢键问题使用较高温度使酶力更发挥

5、 酶浓度影响：使用DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍连接平末端酶用量要比连接黏端10-100倍进行黏末端连接需先行稀释稀释液与酶保存缓冲液相同或类似稀释液酶能间保持力便于随取用

6、 DNA浓度影响：要求环化效连接产物 DNA浓度高般超20nmol/L要求线性化连接产物 DNA浓度高些至少接近推荐浓度用质粒载体进行片段克隆及双酶切片段连接反应DNA浓度应降低甚至DNA总浓 度低至几nmol/L另据研究T4 DNA连接酶DNA末端表观Km值1.5nmol/L所连接DNA浓度应低于1nmol/L即应具2nmol/L末端浓度

① pH＜4的酸性溶液中，碱基及核糖的糖苷键及磷酸二酯键容易断裂。与RNA相比，由于2‘位置的脱氧，相对来说耐碱性较强。

② DNA一般来说怕酸不怕碱。

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氨水也就是氨气溶于水之后的溶液，氨气和水生成水合物之后会水解生成NH4+和OH-两种离子，使得氨水呈碱性，但碱性较弱，而且随着浓度的增加，氨水挥发性越强；高浓度的氨水使得DNA分子结构遭到破坏，从而变性失活。不过DNA虽然失活，其主要结构并没有改变，所以不能说氨水能消灭DNA，像浓硫酸那样能使有机物脱水碳化才能说是可以消灭DNA。

DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的PH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。因为高浓度氨水也属于极端PH值范畴，所以也能是DNA失活。

检查细菌培养情况，将明显浑浊的菌液倒在已经编号的2ml的沉菌用离心管里，在约12000转/min的速度下离心沉淀1分钟，保证无悬浮物后取出；将离心管倒扣在卫生纸上，用力敲击，至液体培养基完全去除；如发现菌体沉淀的少，可多加2ml菌液重复沉菌一次。

在离心管中加入250µl 加过RNaseA1酶的Buffer S1，用振荡器震荡，直到沉淀完全充分悬浮。

1. Buffer S1是什么？主要组分是什么？

50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0

2. Buffer S1的功能是什么？

50 mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果Buffer S1中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

EDTA ：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在Buffer S1中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 ——但是对于测序而言，我们是用水溶解质粒，所以EDTA是必须的。

3.如果抽提质粒恰好Buffer S1用完了，可不可以用水代替？

只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

质粒抽提流程详解——裂解

在离心管中加入250µl Buffer S2，上下缓慢颠倒7~8次至混旋液澄清（这步的操作时间不得超过4分钟）；

☆ 注意：颠倒时不能太剧烈，否则会有核DNA污染；如果Buffer S2因温度过低有SDS沉淀析出，可将其放置55~60C水溶锅中适当加热至澄清后再用。

1.抽提质粒的原理是什么？

碱裂解法

2. Buffer S2是什么？主要组分是什么？

0.2 N NaOH / 1% SDS

SDS：十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS），是洗洁精的主要成分。常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。

3.Buffer S2的功能是什么？

NaOH：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解。用了不新鲜的NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

4.加入Buffer S2为何时间不能太久，动作要轻柔？

第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

质粒抽提流程详解——中和

加入400ul Buffer S3，剧烈颠倒5~10次，使之充分中和，同时将大块白色沉淀振成小块，便于离心。

在约13600转/min的速度下离心沉淀12分钟，如有因沉淀不完全引起的白色絮状物质，可重复振荡离心直至沉淀完全。

1. Buffer S3是什么？主要组分是什么？

3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸

2.加入Buffer S3后出现的白色沉淀是什么？&3.Buffer S3的功能是什么？

每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，与此同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

2 M的醋酸的作用是什么？

是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

质粒抽提流程详解——纯化

将上步离心上清液用移液器转移到吸附柱上，在约10500转/min的速度下离心1分钟。

注意：不要把沉淀物转移到吸附柱里，1个样品使用1个枪头。

为何离心上清液经离心后，质粒DNA就被吸附到膜上？

在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。

质粒抽提流程详解——洗涤脱盐

取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，加入500ul Wash Solution到柱子中，高速离心（10,000rpm)30秒。

重复上述步骤一次。

取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，最大速度离心2分钟

使用Wash Solution要进行两次洗涤，目的是使残留的蛋白、盐离子等杂质更充分的被去除，保证硅胶膜上吸附的DNA尽量纯。

质粒抽提流程详解——产物回收

将DNA吸附柱移入新的1.5ml离心管中，在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 预热无菌双蒸水，室温放置2分钟后12，000rpm离心1分钟，离心管底即为质粒DNA。

亚硫酸盐是一种含氧酸盐，分子式为Na2SO3其酸根为亚硫酸根SO3 2-.

其酸酐为二氧化硫SO2.在地表水中通常不存在亚硫酸盐。

如果亚硫酸盐排放到出水中来源于市政污水,那么它就很容易氧化成硫酸盐。

亚硫酸钠是亚硫酸盐存在的最常见的形式，是优良的还原剂，用来清除氧。

因为对人有危害，必须定期监测锅炉和工艺用水中的亚硫酸盐的浓度，

这样就可以避免额外的处理.污水处理厂如果使用二氧化硫来去除剩余的氯,

那么就必须检测出水中的亚硫酸盐的含量。