苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理,以及这三者的作用是什么

1、苯酚氯仿抽提法

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

2、离心柱法

离心柱法DNA提取它的优点是比传统的酚氯法提取的纯度高，有利于RNA保护，而且能进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，渐逐取代了传统DNA提取方法，被高校科研所等市场普遍接受。

离心柱法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。

同时离心柱法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。

当面对突发疫情时，更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。

3、磁珠法

磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：

（1）能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的。

（2）操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成。

（3）安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，保护了实验人员的身体健康。

（4）磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

（5）灵敏度高，适合法医样本等痕量DNA提取。

扩展资料：

磁珠法的原理是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便地实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。

原理：

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。

5

min

2．溶解DNA：

3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3

min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5

min

8．DNA的鉴定：沸水浴5min

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DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用SDS处理细胞③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A.

利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M

氯

纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的

氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA

钠盐沉淀出来.

B.

也可用0.15

MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA

时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA

的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA

的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.

（2）.阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA

.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA

联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA

的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA

。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%

，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

试剂盒特点

◆ 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。

◆ 不需要使用有毒的苯酚等试剂。

◆ 快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。

◆ 结果稳定，产量高（典型的产量3ml全血可提取出75-150μg），纯度达1.7～1.9，长度可达50Kb-150kb，可直接用于构建文库，PCR、Southern-blot和各种酶切反应。

试剂盒组成保存 20次 50次

（DP2101）（DP21002）

红细胞裂解液 室温 200 ml500 ml

细胞核裂解液 室温 65 ml160 ml

蛋白沉淀液室温 22 ml 50 ml

DNA溶解液室温 10 ml 20 ml

本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。