CTAB的作用

CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,在于液相中； CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.

用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?

使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用.缺点：1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA.2.不能完全抑制RNase的活性.

氯仿的作用?

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?

用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀.

简言之,无论哪种抽提方法,药品的作用基本都是一样的.

主要提一下CTAB法提取植物基因组DNA原理。

1 将植物组织置于2 mL离心管，加入2颗灭菌钢珠，液氮冷冻，球磨仪研碎；

2 加入800 μL CTAB提取缓冲液，65℃水浴1 h，期间每隔15 min颠倒混匀若干次；

说明：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、 多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

Tris-HCl

提供缓冲环境，防止核酸被 破 坏。

EDTA

抑制DNase活性。

NaCl

提供高盐环境，使DNA充分溶解。

β-巯基乙醇

抗氧化剂，去除酚、糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。

3 加入800 μL苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上层水相转移至新的2 mL离心管；

4 加入等体积氯仿：异丙醇（24:1），上下颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，将上清转移至新的1.5 mL离心管；

说明：原理同上一步，抽提更彻底。

5 加入0.6倍体积异丙醇，-20℃沉淀30 min以上；

说明：异丙醇用来沉淀DNA，沉淀所需体积小，但难挥发。

6 12000 rpm离心10 min，弃去上清，加入75%乙醇洗涤两次；

说明：其实乙醇也可用于DNA的沉淀，其虽易挥发，但所需体积大，因此普遍使用异丙醇沉淀，然后用乙醇洗涤除去残留的异丙醇。另外，DNA不溶于乙醇，但CTAB和一些蛋白质可溶，低温乙醇还可抑制DNase活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。

7 真空干燥仪干燥40 min左右，加水溶解DNA。

ctab溶于乙二醇。

稀释CTAB的良溶剂是纯水，也可以溶于极性质子溶剂比如甲醇、乙醇和IPA，微溶于乙二醇醚和丙二醇醚。配置3%的CTAB就是3克CTAB+97克纯水或者IPA即可，需要注意的是CTAB是阳离子弱酸性表面活性剂，它与水互溶时要提前除去硬水成份防止缔合沉淀，请小试并酌情参考。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）呈白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水，震荡时产生大量泡沫，能与阴离子、非离子、两性表面活性剂有良好的配位性。具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、生物降解性及杀菌等性能。

1.称取0.1g左右的植物组织，放入2ml离心管，加入600ul的DNA提取缓冲液

（Buffer ①+Buffer②+Buffer③+Na2HSO3）。

2.研磨彻底，65℃水浴50min，中间每隔15分钟颠倒混匀一次。

3.加入600ul的氯仿/异戊醇24:1，颠倒混匀。

4.14000rpm离心10min，取上清液500ul左右到新的1.5ml离心管。

5.加入等体积的异丙醇（约500ul），混匀后放置-20摄氏度，30min。

6.14000rpm，4℃，10min。

7.小心倒掉异丙醇（注意沉淀），加入1ml 75%的乙醇，颠倒混匀，洗涤DNA。

8.14000rpm，离心5min，倒掉75%乙醇。

9.重复步骤8。

10.将DNA沉淀放置于超净台，15min，彻底去除多余的乙醇。

11.加入50-200ul的ddH2O，测浓度，跑电泳，鉴定DNA的质量。

12.置于-20℃，保存。

1.Buffer①（200ml）：D-山梨醇-12.754g，Tris pH8.-2 2.42g，EDTANa2-0.3722g。

2.Buffer②（200ml）：Tris（pH7.5）)4.8456g，EDTANa2-3.722g，NaCl-23.492g，CTAB-4g。

3.Buffer③（200ml）：N-月桂酸肌氨酸钠盐-10g。

4.Na2HSO3。

Buffer①--13.75ml + Buffer②--31.25 ml+ Buffer③--5ml+NaHSO3--0.19g = 50ml DNA提取缓冲液。

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中。

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。CTAB 4g

NaCl 16.364 g。

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)。。

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

扩展资料：

适当的加一下热，比如50度或者60度，可以快速溶解，般这个温度对试剂的品质没有什么影响如果不是浓度太高的话。

如果浓度太高，可能冷却后又会沉淀析出来。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl) CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物而不沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

2×CTAB提取缓冲液成分：2%(w/v)CTAB，100mM Tris (pH 8.0)，20mM EDTA,1.4 MNaCl,，0.2%(v/v) 还原剂(随用随加) 。

参考资料来源：百度百科——十六烷基三甲基溴化铵

《转的》

CTAB

(hexadecyltrimethylammonium

bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L

NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注:CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方:

Tris-HCl

(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性

NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中

CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方:

(1)

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染同时它也能和多糖结合，有效去除多糖

(2)

蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化

(3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M

NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500

μL

DNA液中加入200μl

20%

PEG8000

(含1.2

M

NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化

(4)

多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

(5)

盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

三、基因组DNA提取常见问题

DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策:重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。

(1)DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题:材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

(2)DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。

提取DNA和RNA所用配方是不一样的。

提取DNA配方

CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

提取RNA配方

2% CTAB（W/V）

2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V）

100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置）

25mM EDTA

0.5g/L 亚精胺Spermidine

2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）

由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。

CTAB即十六烷基三甲基溴化胺，别名溴化十六烷基三甲基胺,鲸腊基三甲基溴化胺，分子式C19H42NBr，理化性质为白色或黄色膏体或固体粉末,有刺激气味.熔点32℃,HLB值15.8,熔于热水、乙醇、三氯甲烷,易熔于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于醚.加热至多24.5—25.2℃分解。有良好的表面活性、稳定性、杀菌性及生物降解性。在强酸及强碱中穏定,耐热、耐光。与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配伍性,对多种油脂具较好的乳化作用.对皮肤及粘膜刺激性小,有轻微脱脂作用。是一种阳离子去污剂，广泛用于润湿、杀菌、抗静电、去污、增溶等方面。

http://wenku.baidu.com/view/b622001e650e52ea55189866.html