biolog微生物鉴定系统

目录1 拼音2 英文参考3 概述4 杜克雷嗜血杆菌的实验室检查方法 4.1 标本采集 4.1.1 取材工具4.1.2 取材部位4.1.3 皮肤黏膜损害取材4.1.4 淋巴结取材 4.2 显微镜检查 4.2.1 材料4.2.2 方法4.2.3 革兰染色4.2.4 结果及解释 4.3 杜克雷嗜血杆菌运送与分离培养 4.3.1 材料 4.3.1.1 运送培养基4.3.1.2 分离培养基 4.3.2 培养条件4.3.3 培养菌落初步鉴定 4.4 生化鉴定试验 4.4.1 氧化酶试验4.4.2 过氧化氢酶试验4.4.3 卟啉试验4.4.4 硝酸盐还原试验4.4.5 堿性磷酸酶试验4.4.6 杜克雷嗜血杆菌生化试验鉴定结果4.4.7 培养意义及注意事项 4.5 运送和分离杜克雷嗜血杆菌培养基的制备 4.5.1 运送培养基BMSGA制备 4.5.1.1 BM成分4.5.1.2 SGA成分4.5.1.3 配制方法 4.5.2 分离培养基制备 4.5.2.1 改良ThayerMartin培养基制备 4.5.2.1.1 成分4.5.2.1.2 配制 4.5.2.2 巧克力琼脂的配制 4.5.2.2.1 成分4.5.2.2.2 配制5 参考资料 1 拼音

dù kè léi shì xuè gǎn jūn

2 英文参考

haemophilus ducreyi [WS/T 191—2017 软下疳诊断]

3 概述

杜克雷嗜血杆菌（haemophilus ducreyi）为兼性厌氧菌，由Ducrey 1889年在意大利发现。杜克雷嗜血杆菌无运动能力，无芽胞，革兰染色阴性，短杆状，两端钝圆，长1.6μm～2μm，宽0.5μm，大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列，少数在细胞内呈团状分布[1]。

4 杜克雷嗜血杆菌的实验室检查方法4.1 标本采集4.1.1 取材工具

棉拭子或藻酸钙拭子。

4.1.2 取材部位

生殖器溃疡或有波动感的肿大淋巴结。

4.1.3 皮肤黏膜损害取材

用无菌棉拭子轻轻擦去溃疡表面的痂皮和污物，再用拭子采取分泌物，从溃疡基底部或边缘取材，做涂片检查或培养。

4.1.4 淋巴结取材

选有波动的淋巴结，消毒淋巴结表面皮肤，用无菌干棉球擦干。用ImL无菌注射器配12号针头，吸取生理盐水0.25 mL～0.5 mL，以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，反复2次～3次后，取抽吸液做涂片检查或培养。

4.2 显微镜检查4.2.1 材料

光学显微镜、无菌拭子、载玻片、注射器、生理盐水。

4.2.2 方法

将标本均匀轻轻地涂在干净的玻片上，然后在空气中干燥，火焰固定。

4.2.3 革兰染色

操作步骤如下：

a） 将经过固定的涂片铺满结晶紫溶液，染30 s～60 s，迅速在流水中洗净。

b） 用碘液铺满涂片，染30 s～60 s，用流水洗净。

c） 用丙酮一乙醇液脱色，直到涂片无紫色脱下为止。通常要10 s～20 s，取决于涂膜的厚薄。避免脱色过分，否则革兰阳性菌可误认为阴性菌。很快在流水中淋洗停止脱色，将过量的水用吸水纸吸干。

d） 用复红液复染1 min，用流水淋洗，用吸水纸吸干。

4.2.4 结果及解释

使用10×100倍油镜检查。

杜克雷嗜血杆菌为革兰染色阴性，短杆状，两端钝圆，长1.6 μm～2μm，宽0.5μm，大多数在细胞外呈链状或鱼群状排列，少数在细胞内呈团状分布。

因生殖器溃疡中常有多种微生物寄居，临床标本直接涂片革兰染色镜检的结果不可靠，假阳性及假阴性较高，故涂片检查只用于初步判断，不作为确诊依据。

4.3 杜克雷嗜血杆菌运送与分离培养4.3.1 材料4.3.1.1 运送培养基

BMSGA运送培养基。主要成分包括：L谷氨酰胺、小牛白蛋白V、3 mg/L万古霉素。

4.3.1.2 分离培养基

1.改良ThayerMartin培养基。主要成分包括：GC基础培养基粉、血红蛋白、1%IsoVitaleX增菌剂、3 mg/L万古霉素。

2.巧克力琼脂培养基。主要成分包括：肉浸液（肉膏液）琼脂、无菌脱纤维血、3 mg/L万古霉素（培养基制备参见附录B）。

4.3.2 培养条件

将标本接种于培养基上，分区划线分离。接种了标本的培养基应置于相对湿度80%以上，培养温度33℃～35℃，5%～10%氧化碳环境（烛缸）中培养。48 h～72 h观看结果。未出现阳性结果的平皿应继续观察7d后才能丢弃。

4.3.3 培养菌落初步鉴定

菌落特征：杜克雷嗜血杆菌经48 h～72 h培养后，可形成直径1 mm～2 mm菌落，菌落光滑、呈半透明状，浅灰色或黄灰色。陈1日性培养物，菌落扁平，颜色变成灰白到棕黄。用白金耳可以完整地将菌落沿琼脂表面推动，即推动试验阳性，为杜克雷嗜血杆菌菌落的典型特征。

革兰染色：从菌落取材做涂片，革兰染色镜检（见A．2）。

4.4 生化鉴定试验4.4.1 氧化酶试验

原理：杜克雷嗜血杆菌酶系统不完善，但能产生弱氧化酶，它产生的氧离子能将氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯胺）氧化成醌类化合物，出现弱颜色反应。但也有报告氧化酶试验阴性的菌株。

方法：将氧化酶试剂配制成0.5%～1.0%水溶液。将溶液滴加于可疑菌落上，观察颜色变化。 A．

结果：在滴加1%盐酸二甲基对苯胺溶液后，一般于15 s～20 s内菌落即呈淡红色，然后逐步变成深紫蓝色，最后呈黑色。

临床意义：氧化酶试验、菌体形态和菌落形态是初步鉴定杜克雷嗜血杆菌的三个重要标准。

4.4.2 过氧化氢酶试验

原理：具有触酶（即过氧化氢酶）的细菌可催化过氧化氢放出初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。

方法（玻片法）：挑取培养基上的菌落，置于干净的玻片上，然后加1滴3%～6%过氧化氢，立即观察结果。

结果：于30 s内有气泡产生者为阳性。

临床意义：杜克雷嗜血杆菌不产生气泡因而为阴性。

4.4.3 卟啉试验

原理：用于检测细菌将盐酸δ氨基γ酮戊酸转变成卟啉及卟吩胆色素原的能力。因为杜克雷嗜血杆菌是严格依赖氯化血红素生长的一种嗜血杆菌，它没有将盐酸δ氨基γ酮戊酸转变成卟啉的能力，试验结果为阴性反应。

方法：在12 mm×75 mm的试管中加入0.5 mL的2 mmol/L盐酸δ氨基乙酰丙酸溶液中制备浓菌悬液（1×109/mL），将试管放在35℃～37℃孵箱中4h。再将试管于暗室中用wood灯照射，观察结果。

结果：出现红色荧光则表示有卟啉存在为阳性。

临床意义：严格依赖氯化血红素的杜克雷嗜血杆菌缺乏转变成卟啉能力，因而呈阴性。

4.4.4 硝酸盐还原试验

原理：硝酸盐还原反应包括两个方面：

1） 细菌在合成代谢过程中，将硝酸盐还原为亚硝酸盐和氮，再由氨转化成氨基酸和细菌内其他    含氮化合物。

2） 在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐替代氧作为呼吸系统中的终末受氢体。硝酸盐的还原    过程因细菌而异，杜克雷嗜血杆菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与试剂中的α萘胺结合而成为Nα萘胺偶氮苯磺酸（红色）。

方法：取48 h的培养物制成浓菌悬液（109/mL），取0.04 mL于小试管中，加入0.04 mL 0.05% NaNO3溶液和0.04 mL的25 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）。在35℃水浴孵育1 h。分别加入0.5%对氨基苯磺酸乙酸溶液和0.5%萘胺乙酸溶液各0.06 mL，摇匀，观察。

结果：2 min～10 min内显色，出现粉红色为阳性，不出现粉红色为阴性。

临床意义：杜克雷嗜血杆菌硝酸盐还原试验阳性。

4.4.5 堿性磷酸酶试验

方法：在含0.5 mL 0.03%无酚磷酸二钠试管中制备浓菌悬液（109/mL）。将试管置37℃水浴孵育4h，加4滴0.5%2,6二溴醌4氯亚胺甲醇溶液，摇匀，置室温15 min。加入0.3 mL n丁醇，摇匀静置5 min。观察。

结果：在丁醇层出现蓝紫色为阳性。

临床意义：杜克雷嗜血杆菌堿性磷酸酶试验阳性。

4.4.6 杜克雷嗜血杆菌生化试验鉴定结果

嗜血杆菌氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阴性，卟啉试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，堿性磷酸酶试验阳性。

4.4.7 培养意义及注意事项

杜克雷嗜血杆菌培养法的敏感性为60%～80%，是目前世界卫生组织推荐和诊断软下疳病人的主要实验室方法。杜克雷嗜血杆菌对环境的抵抗力很弱，为提高培养的成功率，标本的离体时间越短越好，取材后应立即接种于分离培养基。对不能及时接种到分离培养基的临床标本，应置于运送培养基，但必须在一周内转种到分离培养基上。

4.5 运送和分离杜克雷嗜血杆菌培养基的制备4.5.1 运送培养基BMSGA制备4.5.1.1 BM成分

BM成分如下：

a） 磷酸氢二钠（Na2HPO4）  10.0 g；

b） 硝酸镁（magnesium nitrate） 0.1 g；

c） 磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g；

d） 氯化钠（sodium chloride） 5.0 g；

e） 氯化钙（Calcium Chloride） 0.1 g；

f） 血红素0.2 g；

g） 巯基乙酸钠（sodium thiglycollate） 1.0 g；

h） Bacto琼脂7.5 g；

i） 蒸馏水990 mL

j） 调pH至7.5。

4.5.1.2 SGA成分

SGA成分如下：

a） 二氧化硒（SeO2） 0.003 mg/L

b）L谷氨酰胺（Lglutamine）3 mg/L

c） 万古霉素（vanycin）3 mg/L

d） 牛血清清蛋白（白蛋白）2.0 g/L

e） 蒸馏水10 mL。

4.5.1.3 配制方法

SGA成分采用孔径为0.45μm滤膜过滤除菌备用。BM成分于121℃灭菌15 min，待冷至50℃，无菌操作加入SGA溶液混匀，分装于带螺旋盖的无菌试管内，每管6 mL，放4℃可用30 d。

4.5.2 分离培养基制备4.5.2.1 改良ThayerMartin培养基制备4.5.2.1.1 成分

GC基础培养基粉

每3.6 g GC基础培养基粉可配100 mL TM成品培养基，其中含蛋白胨1.5 g、玉米粉0.1 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）0.4 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.1 g、氯化钠（NaCl）0.5 g和琼脂1.2 g。

VCN抑菌剂

1 mL溶液中含万古霉素（vanycin） 300μg、粘菌素（colistin） 750μg和制霉菌素（nystatin）1250单位。为抑制变形杆菌可加三甲氧芐氨嘧啶500μg。制成后立即用完或贮存200C以下于2周内用完。

lsoVitaleX增菌剂

每1L蒸馏水中加入成分如下：

a） 维生素B12 （vitamin B12） 0.01 g；

b） L谷氨酰胺（Lglutamine）  10.0 g；

c） P氨基苯甲酸（Paminobenzoic acid） 0.012 g；

d） 腺嘌呤（adenine）1.0 g；

e） 鸟嘌呤（guanine）0.03 g；

f） 二磷酸吡啶核苷酸（diphosphopyridine nucleotide osidized，coenzyme Ⅰ）0.25 g；

g） 辅羧酶（cocarboxylase）0.1 g；

h） 硝酸铁（ferric nitrate）0.02 g；

i） 盐酸硫胺（thiamine HCl） 0.003 g；

j） L半胱氨酸（Lcysteine） 25.9 g；

k） L胱氨酸（Lcystine）1.1 g；

1） 葡萄糖（dextrose） 100 g。

4.5.2.1.2 配制

以配500 mL TM培养基为例，具体配制如下：

a） 制取双倍浓度的基础培养基：将GC基础粉18 g溶于235 mL蒸馏水中（用500 mL烧瓶），充分摇匀，边加热边搅动，直至煮沸1 min，使之完全溶解。

b） 将5g血红蛋白粉加到250 mL水中制成2%溶液。混合时，5g血红蛋白先加水5 mL～10 mL，研成糊状，再逐步加入蒸馏水，使整个溶液成匀浆状。也可用2%血红蛋白溶液成品。

c） 将上述二液分别以121℃高压灭菌15 min后冷却到500C左右备用。2%血红蛋白溶液成品不必高压，只需在临用前稍加热即可。

d） 配制增菌液：每安瓿增菌剂加入随同附来的稀释液10 mL，使溶解。

e） 配制抑菌剂：每安瓿抑菌剂用无菌操作加入蒸馏水5 mL，摇动，使充分溶解。

f） 用无菌操作将2%血红蛋白溶液250 mL、增菌液10 mL、抑菌剂5 mL和GC培养基235 mL混合。

总体积为500 mL，可倒70 mm平皿25个～30个。

4.5.2.2 巧克力琼脂的配制4.5.2.2.1 成分

肉浸液（或肉膏液）琼脂（pH 7.2～7.4）1000 mL，无菌脱纤维血（羊血或兔血）80 mL～100 mL，万古霉素3 mg/L（或多粘菌素B 25 U/mL）。

4.5.2.2.2 配制

别名： 硫代乙醇酸钠

Sodium Thioglycolate

分子式：C2H3NaO2S

分子量：114.09

熔点 >300°C (572°F)

分子式：C2H3NaO2S

作用：它在铜钼矿浮选中，用作铜矿物和硫铁矿的抑制剂。采用先进的技术以及优良的工艺精制而成，对铜，硫以及其他物质有明显的抑制作用，从而有效地提高了钼精矿的品味。

利用重结晶原理

温度升高时，硫酸钠的溶解度升高缓慢，而硫代硫酸钠的溶解度升高极快（可以查表）

硫代硫酸钠：0℃ 50.2、10℃ 59.7、20℃ 70.1、30℃ 82.2、40℃ 105、50℃ 142、60℃ 191、80℃ 231、100℃ 245 （25℃ 75.9）；

0℃ 4.9 10℃ 9.1 20℃ 19.5 30℃ 40.8 40℃ 48.8 50℃ 60℃ 45.3 70℃ 80℃ 43.7 90℃ 42.7 100℃ 42.5

过程如下：

将混合物配制成热溶液，加热浓缩，高温下硫酸钠溶解度远远小于硫代硫酸钠，所以硫酸钠大量析出，而硫代硫酸钠仍然留在母液中，趁热过滤，滤液冷却至室温，冰水浴，即可析出硫代硫酸钠

乙二胺四乙四钠？应该是EDTA（乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠）吧？如果像你所说是四钠，就可能是EDTA在氢氧化钠溶液里得到的钠盐（）。一般实验室会用已知标准浓度的的CaCO3进行标定，是一种络合反应。

含量测定 采用配位滴定法。先将乙二胺四乙酸用KOH配制成pH为12.0～13.0的试样液。以酸性铬蓝K和萘酚绿作混合指示剂，用试样液滴定于120℃干燥过的分析纯CaCO3，当溶液由紫红色变为蓝绿色即为终点。EDTA多用于水质监测中的络合滴定分析法。由于本身可以形成多种络合物，所以可以滴定很多金属。元素周期表里的Ⅱ，Ⅲ，镧系，锕系金属都可以用EDTA滴定。但是最常用的是用来测定水的总硬度。 测定水的总硬度就是测定水中钙、镁离子的总含量，可用EDTA配位滴定法测定： 滴定前： M + EBT M-EBT (红色) 主反应： M + Y MY 终点时： M-EBT + Y MY + EBT (红色) （蓝色） 滴定至溶液由红色变为蓝色时，即为终点。 滴定时，Fe3+、Al3+等干扰离子可用三乙醇胺予以掩蔽；Cu2+、Pb2+、Zn2+等重属离子，可用KCN、Na2S或巯基乙酸予以掩蔽。 将水中的Ca2+离子和Mg2+离子都看作Ca2+离子，并将其质量折算成Cao的质量，并把1L水中含10mgCaO称为1度。

巯基乙酸的合成方法介绍

1.

硫氢化钠法 硫氢化钠法制巯基乙酸的反应原理是在水溶液中利用亲核试剂HS-离子与氯乙酸钠发生亲核取代反应,生成巯基乙酸。凡是在水溶液中能提供HS-离子的物质(如硫氢化钠、硫氢化钾、硫氢化铵、硫化氢、硫化钠、硫化钡矿等)都可为硫氢化钠法的原料。 硫氢化钠法原料易得,生产成本低,是大规模生产的首选方法,但要获得较高浓度的巯基乙酸,必须采用高压生产,这使得生产投资大,设备材质要求高,难适应于我国的矿山企业和中小企业生产而采用常压生产,巯基乙酸浓度低。

2.

硫代硫酸钠法 硫代硫酸钠法(Bunte法)的原料易得,收率较高(一般可达90%以上),生产成本较低,生产的产品可直接应用于选矿厂。但硫代硫酸钠法目前生产的巯基乙酸(盐)浓度较低(硫化物水解的巯基乙酸钠质量浓度通常小于9% ),不适宜提纯或直接运输销售。

3.

硫脲法 硫脲法生产的巯基乙酸产

晚上好，一般情况下是不反应的。巯基乙酸钠上的巯基由于和乙酸形成配位阴离子酸根而被钝化，碱性次氯酸钠的氧化能力不足以把它们分离使巯基氧化成磺基，所以两种在水溶液中应该是缓冲共存的物理互溶类似PBS或者Tris请酌情参考。如果去掉阳离子的钠盐是独立的非离子化合物，氧化能力再强一些就有可能生成磺酸或者砜结构了。