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木聚糖酶活性测定方法

（规范性附录）

A 1 方法原理

样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解，用DNS（3，5－二硝基水杨酸）试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。

A 2 活性单位定义

在温度为50℃，pH 5.3条件下，1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量，为1个木聚糖酶的活性单位（BXU）。

A 3 应用范围

本法用于来源于曲霉属（Aspergilious）或木霉属（Trichoderma）的木聚糖酶样品的测定。当分析其它来源的酶时，该法的线性需要校正。本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。

A 4 测定条件

A 4.1 底物： 燕麦木聚糖

A 4.2 pH： 5.3

A 4.3 温度： 50℃±0.5℃

A 4.4 保温时间： 5min

A 5 仪 器

A 5.1 超级恒温水浴锅：50℃

A 5.2 水浴锅： 100℃

A 5.3 旋涡磁力搅拌器

A 5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度

A 5.5 分析天平：感量0.0001g

A 6 试 剂 所有试剂溶液均需用去离子水配制。

A 6.1 柠檬酸缓冲液（0.05mol/l、pH5.3）

溶解10.5g柠檬酸（C6H8O7•H2O）于800ml水中，并用1mol/L氢氧化钠调pH至5.3，（消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠），再用水定容至1000ml。

A 6.2 底物—1%燕麦木聚糖

称取1.0g燕麦木聚糖，溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。用柠檬酸缓冲液定容至100ml。此底物溶液在4℃时最多保存一周，或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存，临用前融解，搅拌均匀使用。

A 6.3 DNS试剂

溶解50.0g 3，5二硝基水杨酸于4000ml水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0g氢氧化钠，使之完全溶解，在继续磁力搅拌下，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000ml。如溶液不澄清，用Wheatman1号滤纸过滤，然后室温保存于深色瓶中。

A 7 样品制备

精确称取样品1.0000g，置于研钵内，加入5ml的柠檬酸缓冲液，研磨片刻，放置30min后，用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。

A 8 测定步骤

A 8.1 试样测定

分别向2支试管加入1.8ml底物溶液，置50℃水浴保温5min。在其中1支试管中加入200μl稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置50℃水浴中，准确保温5min。分别加入3.0ml DNS试剂至2支试管中，搅拌均匀。在另一试管（空白管）中加入200μl缓冲液。同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。在540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。继续做2个重复测定。

A 8.2 标准曲线的制定

A 8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液

将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。储备液可分成小量在-20℃下冰冻。使用前，融解并混合均匀。

A 8.2.2 配制标准稀释液

用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：

稀释比例 木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml)

1+0 10.0 33.33

1+1 5.0 16.67

1+2 3.33 11.11

1+4 2.0 6.67

A 8.2.3 制备标准曲线

每种标准稀释液做2次重复测定。分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液，50℃水浴保温5min。加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液，在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。每批样品制备一次标准曲线。

A 9 测定结果的计算

木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖浓度*1000*稀释倍数）/（样品重量*反应时间300S）

饲用酶制剂中木聚糖酶酶学性质的研究2006-09-27 10:16摘 要 木聚糖酶是饲用酶制剂中的主要酶种之一，通过对某商品酶制剂中的木聚糖酶所进行的酶学性质的研究表明：该木聚糖酶的最适pH值为4.5，最适反应温度为50℃，干热稳定性良好，Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe3+对本木聚糖酶有抑制作用，而Mg2+、Na+及（NH4）2SO4能提高此木聚糖酶的活性。

关键词 饲用木聚糖酶；酶学性质；热稳定性

中图分类号 S816.3

在我国饲料生产中，配合饲料中除一般玉米-豆粕型日粮外，实际上更多的情况是在玉米-豆粕型日粮基础上加入10%～40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲用原料，但麦类、谷物和糠麸等副产品中含有许多抗营养因子，如木聚糖[1]，限制了其在饲料中的大量应用。饲料中添加木聚糖酶能降解木聚糖等非淀粉多糖，降低肠道粘度，提高饲料利用率，故开发木聚糖酶市场前景广阔[2-5]。另外，国外低价格小麦、大麦产品的涌入，将进一步刺激木聚糖酶的市场需求。为了了解常用饲用酶制剂中木聚糖酶的酶学性质，我们对市场上某种木聚糖酶进行了最适pH值、最适反应温度、底物针对性、热稳定性、不同金属离子对其酶活的影响等实验，以期对木聚糖酶的保存、应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1．1 实验材料

精密pH计（±0.01）、万分之一电子天平、UV200分光光度计、恒温水浴锅、 离心机；木聚糖酶由四川某生物公司提供。

1．2 酶活测定（采用改良的DNS法[6-8]）

1.2.1 酶活单位定义

在50℃、pH值为5.0条件下，每分钟从1.0%木聚糖酶溶液中释放1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活单位（U）。

1.2.2 1.0%底物配制

准确称取1g燕麦木聚糖（sigma-X0627）加入醋酸缓冲液中，加热、磁力搅拌溶解，定容至100ml,保存在4℃的冰箱内（3d有效）。

1.2.3 DNS试剂的配制

取酒石酸钾钠182.0g溶于500ml水中，加热（不超过60℃），在热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g、NaOH 21.0g、苯酚5.0g、亚硫酸钠5.0g，搅拌使它们溶解，冷却后定容至1 000ml，贮于棕色瓶中，2周后方可使用。

1.2.4 活力测定步骤

在0.1ml木聚糖底物中加入0.1ml稀释好的待测酶液，50℃水浴中反应10min，立即加入0.6ml的DNS试剂，沸水浴中煮15min，补加4.2ml水后，测定其OD550值。

2 实验设计与结果

2．1 木聚糖酶最适pH值

用0.1M柠檬酸和0.2M磷酸氢二钠溶液配制pH值范围为3～7的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，在不同的反应pH值条件下测定其酶活，以酶样最大吸光度的酶活为100%，在其它pH值条件下的酶活为最大吸光度酶活的百分数即为该酶在此pH值条件下的相对酶活（见图1）。

结果表明，该木聚糖酶在pH值为4.5的条件下，酶活力最高,因此,可以确定该木聚糖酶的酶活测定的最适pH值为4.5左右。由图1可知,该酶的pH值在4～5时相对活力超过91%，超出这一pH值范围后，酶活力下降，付五兵等认为这与pH值对酶蛋白活性部位中质子移变基团离子化状态的影响和该酶对pH值的稳定性等因素有关[9]。

2．2 木聚糖酶最适反应温度

在最适pH值条件下，分别设置不同的反应温度，并测定该条件下的木聚糖酶活，以酶样最大吸光度的酶活为100%，在其它温度下的酶活为最大酶活的百分数即为该酶在其温度下的相对酶活（见图2）。

从图2可见，反应温度对该木聚糖酶酶活的测定影响很大， 50℃时酶活最大。所以，我们确定该木聚糖酶的最适反应温度为50℃。

2．3 木聚糖酶底物针对性实验

在最适pH值及最适温度条件下，分别以1.0％桦木木聚糖和1.0％燕麦木聚糖作为底物，测定在不同底物下的酶活。并以燕麦木聚糖为底物时的酶活为100%，桦木木聚糖作为底物时的酶活为燕麦木聚糖作为底物时酶活的百分数即为其相对酶活。

木聚糖酶是一种复合酶，含有多种酶蛋白组分，从已有的研究结果可以发现，能产生木聚糖酶的微生物至少有20种，而且不同的微生物产生的木聚糖酶通常也是不同的。另外，底物中作用成分含量及分子结构的不同，也必定会造成酶活测定的不一致，研究表明，选用不同底物时测得木聚糖酶酶活差异较大[5]。为此，对该木聚糖酶对不同底物进行了酶活针对性实验。实验结果表明，以桦木木聚糖作为底物时的酶活为以燕麦木聚糖作为底物时酶活的88.62%，而李莲等人研究的木聚糖酶底物针对性实验则显示桦木木聚糖优于燕麦木聚糖[10]。

2.4 木聚糖酶反应进程曲线的测定

将木聚糖粗酶液用30％（NH4）2SO4沉淀，离心15min去沉淀，取上清液；上清液再用60％（NH4）2SO4沉淀，离心后将沉淀溶解于0．2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）中，上Sephades-G100色谱柱进行分离纯化，用相同的缓冲液洗脱，收集含木聚糖酶的组分，冻干得纯酶。用纯化得到的酶进行如下的反应进程测定。

按照反应时间20、40、60、70、80、90、100、120min进行分组，每组分别添加0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml经过适当稀释的木聚糖酶，不足部分用醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值为5．0）补足至最终体积为0.1ml，按体积比为1：1加入1．0％的木聚糖。50℃水浴条件下按相应的反应时间进行反应，以相对应的灭活酶液加0.6ml DNS试剂和1．0％的木聚糖0.1ml作对照，完毕后在OD550处进行测定。以反应时间（min）为横轴，吸光值为纵轴，可给出不同酶添加量时的反应进程曲线（见图3）。

从图3木聚糖酶的反应进程曲线中可以看出，该木聚糖酶液添加量为0.02～0.1ml，时间为40min之内，反应进程曲线均呈线性，所以在这个范围内进行测定，求出的反应速度为最大反应初速度，有利于酶活的正确测定。

2.5 木聚糖酶热稳定性研究

2.5.1 干热处理对木聚糖酶活的影响

在55、65、75、85、95℃恒温干燥箱中将样品处理10min，立即提取，测定酶活，并以未经干热处理的样品中的酶活为100%，干热处理后的酶活为处理前酶活的百分数即为该酶经干热处理后的剩余酶活，结果见表1。

从表1可以看出，该木聚糖酶对于干热处理温度不敏感，其耐干热处理的能力较强。

2.5.2 湿热处理时间对酶活的影响

准确称取1.000 g样品加入10％的水（加水后总含水量约17%～20%），充分搅拌后盖严，于85℃恒温干燥箱中处理2、5、10和30min，立即取出并测定其酶活，以未经湿热处理的酶活为100%，湿热处理后的酶活为处理前酶活的百分数即为该酶经湿热处理后的剩余酶活，结果见表2。

由表2可以看出，湿热处理同干热处理相比对酶活的影响要大得多，这是由于在湿热处理条件下，更易使蛋白质变性[9]。实验可以看出该酶具有较好的热稳定性,含水分17%左右85℃条件下30min能保留42.24%的活力，在饲料加工时不会因制粒的高温湿热而引起酶活力大幅下降。

2．6 不同金属离子对木聚糖酶酶活的影响

用pH值为5.0的缓冲液配制的10mg/ml燕麦木聚糖溶液中分别加入不同种类的金属离子，并使反应体系中各离子终浓度为5mmol/l。以不加任何离子的木聚糖液作为底物时所测出的酶活值规定为100％，各种金属离子条件下所测出的酶活力为其百分数，即可得到该酶在其条件下的相对酶活,结果见表3。

由表3可以看出，此酶对5mmol/l的金属离子不太敏感， Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+对于木聚糖酶的活性有一定的抑制作用，其中Mn2+、Fe3+的抑制作用最强，酶活损失约26.53％～29.71％，其次为Zn2+、Cu2+，酶活损失约3.73％～12.56％，Ca2+、K+对木聚糖酶活影响不大；此外，Na+、Mg2+及(NH4)2SO4对酶活性有一定的激活作用。说明金属离子对该酶的影响小于其它一些报道，可能是不同来源的木聚糖酶对金属离子的敏感程度有一定的差异[10,11]，因此，饲料中添加的金属离子对该木聚糖酶酶活的影响不大。

3 讨论

本文研究的木聚糖酶最适pH值和最适温度与其它报道的木聚糖酶的特性相似,而耐热性能较好，是已有报道的木聚糖酶中最优的一种性能，在85℃下湿热处理30min剩余酶活42.24%，而现用的饲用酶制剂中木聚糖酶在85℃湿热处理10min剩余酶活为34.62%[10]，由于此酶的热稳定性很好,可以保证在饲料加工的制粒过程中减少酶活损失。另外，Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe3+对本木聚糖酶有抑制作用；而Na+、Mg2+及（NH4）2SO4对其酶活有一定的激活作用。

从该木聚糖酶的特性看，动物肠道内的温度、pH值对其活性影响不大，而且能耐受制粒过程中的高温，这使其在动物饲料中的运用具有独特优势。

DNS试剂配制标准

Ghose法 DNS试剂的配制

甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。

乙液：将255 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。在棕色瓶内保存一年有效。

轻工业部标准DNS试剂的配制

称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。

DNS试剂用途：

1.在生化试验中，DNS常用于还原糖含量的测定。

2.也可用于生物质中半纤维素含量的测定。它们均要与标准葡萄糖曲线进行比对。