氮成盐反应条件

实验技术十七　甲基橙的制备

【实验目的】

（1）熟悉重氮化反应和偶合反应的原理。

（2）掌握甲基橙的制备方法。

（3）学会用冰水浴控温。

（4）巩固抽滤、重结晶、干燥等操作。

【实验原理】

甲基橙是指示剂，它是由对氨基苯磺酸重氮盐与N，N－二甲基苯胺的醋酸盐，在弱酸性介质中偶合得到的。偶合首先得到的是嫩红色的酸式甲基橙，称为酸性黄，在碱中酸性黄转变为橙黄色的钠盐，即甲基橙。

本实验主要运用了芳香伯胺的重氮化反应及重氮盐的偶合反应（又称偶联反应）。由于原料对氨基苯磺酸本身能生成内盐，而不溶于无机酸，故采用倒重氮化法，即先将对氨基苯磺酸溶于氢氧化钠溶液，再加需要量的亚硝酸钠，然后加入稀盐酸。

反应过程如下所示：

【物理常数】

见表5－7。

表5－7　主要反应试剂及产物的物理常数

【仪器及药品】

1.仪器

真空泵、漏斗、抽滤瓶、布氏漏斗、酒精灯、滤纸、铁架台、铁圈、火柴、烧杯、温度计、圆底烧瓶、分液漏斗、表面皿。

2.药品

二水合对氨基苯磺酸（0.01mol）、N，N－二甲基苯胺（0.01mol）、亚硝酸钠（0.011mol）、10%氢氧化钠溶液、浓盐酸、冰醋酸、氯化钠、饱和氯化钠溶液。

【实验步骤】

1.重氮盐的制备（重氮化反应）

在100mL烧杯中放置对氨基苯磺酸晶体2.1g（0.01mol），加入10mL　5%氢氧化钠溶液，在温水浴中加热溶解后冷至室温。

另将0.8g亚硝酸钠溶于6mL水，加入上述溶液中，用冰浴冷至0～5℃。

在不断搅拌下，将3mL浓盐酸与10mL水配成的溶液慢慢滴加到上述混合液中。边滴加边搅拌，控制温度在0～5℃之间。滴完后用碘化钾－淀粉试纸检验，试纸应为蓝色。继续在冰浴中搅拌15min使反应完全，可观察到白色细粒状的重氮盐析出。

2.偶合

将1.2g（1.3mL）N，N－二甲基苯胺和1mL冰乙酸在试管中混匀，慢慢滴加到上步制得的重氮盐的冷的悬浊液中，同时剧烈搅拌，甲基橙呈红色沉淀析出。滴完后继续在冰浴中搅拌10min使偶合完全。向反应物中加入13～15mL　10%氢氧化钠溶液并搅拌，直至对石蕊试纸显碱性，甲基橙粗品由红色转变为橙色。

3.盐析、抽滤

将烧杯从冰水浴中取出恢复至室温。加入5g NaCl，在不断搅拌下，在沸水浴中沸腾约10～15min，冷至室温后置于冰浴中冷却，待甲基橙全部重新结晶析出后，抽滤收集结晶。用饱和NaCl溶液冲洗烧杯两次，每次用10mL，并用这些冲洗液洗涤产品。

4.重结晶

将滤饼连同滤纸移到装有70mL热水的烧杯中，微微加热并且不断搅拌，滤饼几乎全部溶解后，取出滤纸，让溶液冷至室温，然后在冰浴中再冷却，甲基橙全部结晶析出后，抽滤至干。产品经干燥后，称重，产量2.3～2.5g。

5.性能试验

溶解少许产品于水中，加几滴稀HCl，然后用稀NaOH溶液中和，观察溶液的颜色有何变化。记录实验现象。

【操作要点及注意事项】

（1）实验用对氨基苯磺酸为二水合物，若用无水对氨基苯磺酸，则只需1.7g即可。

（2）本反应温度控制相当重要，制备重氮盐时，温度应保持在5℃以下。如果重氮盐的水溶液温度升高，重氮盐会水解生成酚，降低产率。

（3）若含有未作用的N，N－二甲基苯胺醋酸盐，在加入氢氧化钠后，就会有难溶于水的N，N－二甲基苯胺析出，影响纯度。

（4）由于产物呈碱性，温度高易变质，颜色变深。反应产物在水浴中加热时间不能太长（约5min），温度不能太高（60～80℃），否则颜色变深。

（5）由于产物晶体较细，抽滤时，应防止将滤纸抽破（布氏漏斗不必塞得太紧）。用乙醇、乙醚洗涤的目的是使其迅速干燥。湿的甲基橙受日光照射，亦会颜色变淡，通常在55～78℃烘干。所得产品是一种钠盐，无固定熔点，不必测定。

（6）对氨基苯磺酸是两性化合物，酸性比碱性强，以酸性内盐形式存在。但进行重氮化反应时，又要在酸性溶液中进行，因此生氨时，首先将对氨基苯磺酸与碱作用变成水溶性较大的细盐。

（7）在重氮化反应中，溶液酸化时生成HNO2（NaNO2→─＋HCl HNO2＋NaCl），同时，对氨基苯磺酸钠亦变为对氨基苯磺酸从溶液中以细粒状沉淀析出，并立即与HNO2作用，发生重氮化反应，生成粉末状的重氮盐。为了使对氨基苯磺酸完全重氮化，反应过程中必须不断搅拌。

（8）用淀粉－碘化钾试纸检验，若试纸显蓝色表明HNO2过量，即

2HNO2→─＋2KI＋2HCl I2＋2NO＋2H2O＋2KCl

析出的I2遇淀粉显蓝色。这时应加入少量尿素除去过多的HNO2。（因为HNO2能起氧化和亚硝基化作用，HNO2的用量过多会引起一系列副反应。）

【思考题】

（1）本实验中重氮盐的制备为什么要控制在0～5℃进行？偶合反应为什么要在弱酸介质中进行？

（2）粗甲基橙进行重结晶时，依次用少量水、乙醇和乙醚洗涤，目的何在？

（3）把冷的重氮盐溶液慢慢倒入低温新制备的氯化亚铜的盐酸溶液中，将会发生什么反应？写出产物的名称。

（4）N，N－二甲基苯胺与重氮盐偶合时为什么总是在取代氨基的对位发生？

（5）何谓偶合反应？偶合反应属于哪种反应类型？为什么偶合反应总是发生在重氮盐与酚类或芳胺之间？

（6）制备甲基橙时，难溶于酸的对氨基苯磺酸大多采用倒转法重氮化，在缓慢加入盐酸溶液的同时，为什么要不断地搅拌？

（7）制备甲基橙时，在重氮化过程中，HNO2过量是否可以？如何检验其过量？又如何除去过量的HNO2？

重氮化偶合反应为芳香第一胺基的特征反应。芳香第一胺基遇亚硝酸钠-盐酸试液发生重氮化反应生成重氮盐，再加碱性β-萘酚，则发生偶合反应，产生橙红色偶氮化合物沉淀。

重氮化偶合反应简介

芳香族伯胺和亚硝酸作用（在强酸介质下）生成重氮盐的反应称为重氮化（一般在低温下进行，伯胺和酸的摩尔比是：1：2.5），芳伯胺常称重氮组分，亚硝酸为重氮化剂，因为亚硝酸不稳定，通常使用亚硝酸钠和盐酸或硫酸使反应时生成的亚硝酸立即与芳伯胺反应，避免亚硝酸的分解，重氮化反应后生成重氮盐。

重氮化反应的机理是首先由一级胺与重氮化试剂结合，然后通过一系列质子转移，最后生成重氮盐。重氮化试剂的形式与所用的无机酸有关。当用较弱的酸时，亚硝酸在溶液中与三氧化二氮达成平衡，有效的重氮化试剂是三氧化二氮。当用较强的酸时，重氮化试剂是质子化的亚硝酸和亚硝酰正离子。因此重氮化反应中，控制适当的pH值是很重要的。芳香族一级胺碱性较弱，需要用较强的亚硝化试剂，所以通常在较强的酸性下进行反应。

重氮化反应可用反应式表示为：

Ar-NH2+2HX+NaNO2=Ar-N2X+NaX+2H2O

重氮化方法

顺法

顺法就是在色基中先加适量水调合，再加入规定量盐酸，在低温和不断搅拌下缓缓加入亚硝酸钠，使重氮化反应完成。色基大红G、色基橙GC与色基紫酱GBC都可采用顺法。重氮化温度为5～10℃，时间约10min，温度过高、时间过短，都不能得到较好的重氮化结果。为使重氮化反应完全，还需将色基重氮化溶液放置15min左右，临用前加适量的醋酸和醋酸钠。大多数溶于稀无机酸的芳伯胺采用此法重氮化。

逆法

逆法重氮化是将色基与亚硝酸钠和适量的冷水调成均匀糊状并加冰冷却，然后将它缓慢倾入不断搅拌的冰盐酸溶液中，使反应完成，色基红B等就是采用逆法重氮化的。在稀酸中难溶解的氨基芳磺酸等用此法重氮化。

HNO5S法

亚硝酰硫酸法用于在稀酸中难溶解的芳伯胺（碱性极弱）重氮化,即先将芳伯胺溶于浓硫酸或冰醋酸中,再向其中加入亚硝酰硫酸溶液。

如果用硫酸,可以加入KCl使氨基变成Cl,但盐酸中加KCl好象没有什麽意义.

重氮化反应

diazo-reaction

一级胺与亚硝酸在低温下作用生成重氮盐的反应。例如：

脂肪族、芳香族和杂环的一级胺都可进行重氮化反应。通常，重氮化试剂是由亚硝酸钠与盐酸作用临时产生的。除盐酸外，也可使用硫酸、过氯酸和氟硼酸等无机酸。脂肪族重氮盐很不稳定，能迅速自发分解；芳香族重氮盐较为稳定。芳香族重氮基可以被其他基团取代，生成多种类型的产物。所以芳香族重氮化反应在有机合成上很重要。

重氮化反应的机理是首先由一级胺与重氮化试剂结合，然后通过一系列质子转移，最后生成重氮盐。重氮化试剂的形式与所用的无机酸有关。当用较弱的酸时，亚硝酸在溶液中与三氧化二氮达成平衡，有效的重氮化试剂是三氧化二氮。当用较强的酸时，重氮化试剂是质子化的亚硝酸和亚硝酰正离子。因此重氮化反应中，控制适当的pH值是很重要的。芳香族一级胺碱性较弱，需要用较强的亚硝化试剂，所以通常在较强的酸性下进行反应。

概述

芳香族伯胺和亚硝酸作用生成重氮盐的反应标为重氮化，芳伯胺常称重氮组分，亚硝酸为重氮化剂，因为亚硝酸不稳定，通常使用亚硝酸钠和盐酸或硫酸使反应时生成的亚硝酸立即与芳伯胺反应，避免亚硝酸的分解，重氮化反应后生成重氮盐。

重氮化反应可用反应式表示为：

Ar-NH2 + 2HX + NaNO2--—Ar-N2X + NaX + 2H20

重氮化反应进行时要考虑下列三个因素：

一、酸的用量

从反应式可知酸的理论用量为2mol，在反应中无机酸的作用是，首先使芳胺溶解，其次与亚硝酸销生成亚硝酸，最后生成重氮盐。重氮盐一般是容易分解的，只有在过量的酸液中才比较稳定，所以重氮化时实际上用酸量过量很多，常达3mol，反应完毕时介质应呈强酸性(pH值为3)，对刚果红试纸呈蓝色．重氮过程中经常检查介质的pH值是十分必要的。

反应时若酸用量不足，生成的重氮盐容易和未反应的芳胺偶合，生成重氮氨基化合物：

Ar-N2Cl + ArNH2——Ar-N＝N—NHAr + HCl

这是一种自我偶合反应，是不可逆的， 一旦重氮氨基物生成，即使补加酸液也无法使重氮氨基物转变为重氮盐，因此使重氮盐的质量变坏，产率降低。在酸量不足的情况下，重氮盐容易分解，温度越高，分解越快。

二、亚硝酸的用量

重氮化反应进行时自始至终必须保持亚硝酸稍过量，否则也会引起自我偶合反应。重氮化反应速度是由加入亚硝酸钠溶液加速度来控制的，必须保持一定的加料速度，过慢则来不及作用的芳胺会和重氮盐作用生成自我偶合反应。亚硝酸钠溶液常配成30％的浓度使用．因为在这种浓度下即使在－15℃也不会结冰。

反应时检定亚硝酸过量的方法是用碘化钾淀粉试纸试验，一滴过量亚硝酸液的存在可使碘化钾淀粉试纸变蓝色。由于空气在酸性条件下也可位碘化钾淀粉试纸氧化变色，所以试验的时间以0.5-2s内显色为准。

亚硝酸过量对下一步偶合反应不利，所以过量的亚硝酸常加入尿素或氨基磺酸以消耗过量亚硝酸。

亚硝酸过量时，也可以加入少量原料芳伯胺，使和过量的亚础酸作用而除去。

三、反应温度

重氯化反应一般在0-5℃进行，这是因为大部分重氮盐在低温下较稳定，在较高温度下重氮盐分解速度加快的结果。另外亚硝酸在较高温度下也容易分解。重氮化反应温度常取决于重氮盐的稳定性，对-氨基苯磺酸重氮盐稳定性高，重氮化温度可在10-15℃进行；1-氨基萘-4-磺酸重氮盐稳定性更高，重氮化温度可在35℃进行。重氮化反应一般在较低温度下进行这一原则不是绝对的，在间歇反应锅中重氮反应时间长，保持较低的反应温度是正确的，但在管道中进行重氮化时，反应中生成的重氮盐会很快转化，因此重氮化反应可在较高温度下进行。

用途：重氮盐的用途很广，其反应分为两大类：一是用适当试剂处理，重氮基被-H、-OH、-X、-CN、-NO2等基团取代，生成相应的方向化合物，因此芳基重氮盐被称为芳香族的“Grignard”试剂；二是保留氮的反应，即与相应的芳胺或酚起偶联反应，生成偶氮染料（或指示剂），如常用的酸碱指示剂甲基橙、甲基红、刚果红，常用染料坚固红A，锥虫蓝等。

四、重氮化方法

重氮化方法有顺法和逆法两种。

1、顺法就是在色基中先加适量水调合，再加入规定量盐酸，在低温和不断搅拌下缓缓加入亚硝酸钠，使重氮化反应完成。色基大红G、色基橙GC与色基紫酱GBC都可采用顺法。重氮化温度为5～10℃，时间约10min，温度过高、时间过短，都不能得到较好的重氮化结果。为使重氮化反应完全，还需将色基重氮化溶液放置15min左右，临用前加适量的醋酸和醋酸钠。大多数溶于稀无机酸的芳伯胺采用此法重氮化。

2、逆法重氮化是将色基与亚硝酸钠和适量的冷水调成均匀糊状并加冰冷却，然后将它缓慢倾入不断搅拌的冰盐酸溶液中，使反应完成，色基红B等就是采用逆法重氮化的。在稀酸中难溶解的氨基芳磺酸等用此法重氮化。

3、亚硝酰硫酸法。用于在稀酸中难溶解的芳伯胺（碱性极弱）重氮化,即先将芳伯胺溶于浓硫酸或冰醋酸中,再向其中加入亚硝酰硫酸溶液。

芳香族伯胺和亚硝酸作用生成重氮盐的反应为重氮化，芳伯胺常称重氮组分，亚硝酸为重氮化剂，因为亚硝酸不稳定，通常使用亚硝酸钠和盐酸或硫酸使反应时生成的亚硝酸立即与芳伯胺反应，避免亚硝酸的分解，重氮化反应后生成重氮盐。原理重氮化反应可用反应式表示为:

Ar-NH2 + 2HX + NaNO2---Ar-N2X + NaX + 2H20

此外，重氮化试剂也可以使用亚硝酰硫酸或者亚硝酸酯在有机溶剂中进行重氮化，但是都不是很常用，前者多用于极难溶的芳胺，后者则用于对水敏感或者后反应要求无水的反应，例如2-氨基吡啶的重氮化，因为相应的重氮盐水溶液中生成后极易分解，所以不能在水中进行重氮化，而通过邻氨基苯甲酸重氮化后热解原位生成苯炔参与反应时，由于分离出干燥的重氮盐非常危险而且后反应要求无水，故也使用亚硝酸酯重氮化的方法。

重氮化方法有顺法和逆法两种。

1、顺法就是在色基中先加适量水调合，再加入规定量盐酸，在低温和不断搅拌下缓缓加入亚硝酸钠，使重氮化反应完成。色基大红G、色基橙GC与色基紫酱GBC都可采用顺法。重氮化温度为5~10℃，时间约10min，温度过高、时间过短，都不能得到较好的重氮化结果。为使重氮化反应完全，还需将色基重氮化溶液放置15min左右，临用前加适量的醋酸和醋酸钠。大多数溶于稀无机酸的芳伯胺采用此法重氮化。

2、逆法重氮化是将色基与亚硝酸钠和适量的冷水调成均匀糊状并加冰冷却，然后将它缓慢倾入不断搅拌的冰盐酸溶液中，使反应完成，色基红B等就是采用逆法重氮化的。在稀酸中难溶解的氨基芳磺酸等用此法重氮化。

3、亚硝酰硫酸法。用于在稀酸中难溶解的芳伯胺(碱性极弱)重氮化,即先将芳伯胺溶于浓硫酸或冰醋酸中,再向其中加入亚硝酰硫酸溶液。

目录1 拼音2 英文参考3 概述4 酸性磷酸酶染色的别名5 化验取材6 原理7 试剂8 操作方法9 正常值10 化验结果临床意义11 附注12 相关疾病 1 拼音

suān xìng lín suān méi rǎn sè

2 英文参考

Acid Phosphatase Stain

3 概述

大部分血细胞内均存在酸性磷酸酶活性，胞质内的酸性磷酸酶在酸性条件下，经水解，再与硝酸铅、硫酸胺作用，可生成棕黄色或棕黄色的硫酸铅沉淀。

4 酸性磷酸酶染色的别名

抗酒石酸酸性磷酸酶染

5 化验取材

血液

6 原理

在酸性条件下，磷酸萘酚ASBⅠ被细胞内酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）水解产生萘酚ASBⅠ，再与重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀。

7 试剂

（1）甲醇丙酮缓冲液：

枸橼酸    0.63g

蒸馏水    30ml

甲醇      10ml

丙酮      60ml

用浓氢氧化钠溶液调整pH至5.4，用前过滤，4～10℃可保存1个月。

（2）基质储备液：磷酸萘酚ASBⅠ100mg，N,N二甲基甲酰胺10ml，混合后置棕色瓶4～10℃可保存2～3个月。

（3）0.1mol/L乙酸缓冲液：甲液：乙酸钠（3H2O）13.6g，溶于蒸馏水1000ml。乙液：冰乙酸6.0ml溶于l000ml蒸馏水中。用乙液滴定甲液至Ph 5.2，放4～10℃可保存3个月。

（4）0.05mol/L乙酸酒石酸缓冲液：L酒石酸3.75g，0.1mol/L乙酸缓冲液490ml，用浓氢氧化钠溶液调整pH至5.2，再加蒸馏水至500ml，410℃可保存3个月。

（5）作用液：0.05mol/L乙酸酒石酸缓冲液50ml，基质储备液1.0ml，坚牢紫酱GBC 25mg，溶解后过滤，立即染色，一次用完。

8 操作方法

新鲜骨髓片或血片，用冷甲醇丙酮缓冲液固定30s，蒸馏水漂洗5～6次，晾干。放入作液37℃保温45～60min，水洗。用苏木素染液或甲基绿染液复染细胞核1～6min，水洗，晾后镜检阳性对照（即酸性磷酸酶染色）：染色过程同上，用0.1mol/L乙酸缓冲液代替乙酸石酸缓冲液。

9 正常值

阳性：粒细胞、T淋细胞、浆细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞和单核巨噬系统细胞。

磷酸萘酚ASBI染色法： 阳性：胞浆中有鲜红色或深红色颗粒，反应强度分为6级：0～5＋（染色颗粒多寡和染色深浅为分级标准）

10 化验结果临床意义

酸性磷酸酶染色能帮助鉴别戈谢细胞（呈阳性反应）及尼曼皮克细胞（呈阴性反应）；红血病及红白血病时幼红细胞呈核旁单侧阳性反应；多发性骨髓瘤细胞、急性单核细胞性白血病、恶性组织细胞增生症细胞、多毛细胞白血病、T淋巴细胞性白血病等均呈强阳性反应。

（1）阳性： 毛细胞白血病。

（2）弱阳性：淋巴细胞白血病。

（3）阴性： 粒系细胞白血病、单核细胞白血病、巨核细胞白血病。

11 附注

酸性磷酸酶染色，必要时加做L酒石酸抑制试验，即为酸性磷酸酶染色被酒石酸抑制；反之则不被酒石酸抑制，产生不溶性红色沉淀，定位于胞质内。这对鉴别诊断多毛细胞白血病有重要意义（L酒石酸抑制试验仍呈阳性），而多发性骨髓瘤细胞，急性单核细胞性白血病细胞、恶性组织细胞增生症细胞均可被L酒石酸所抑制，阳性反应明显减弱。

12 相关疾病

甲苯与溴在三溴化铁下反应生成对溴甲苯,对溴甲苯与金属镁在无水乙醚中反应生成对甲基苯基溴化镁格氏试剂,向该格氏试剂中通入CO2,再用水水解,就得到对甲基苯甲酸. 甲苯与硫酸浓硝酸合成TNT，铁粉还原得到2-甲基均苯三胺，醋酐酰化得三酰化物，冷硝酸硝化单硝化，溴代，铁粉盐酸还原并水解，与亚硝酸钠作用生成重氮盐，加热分解，得间溴甲苯。无色澄清液体。有苯样气味。有强折光性。能与乙醇、 乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳和冰乙酸混溶，极微溶于水。相对密度 0.866。凝固点-95℃。沸点110.6℃。折光率 1.4967。闪点（闭杯） 4.4℃。易燃。蒸气能与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限 1.2%～7.0%（体积）。低毒，半数致死量（大鼠，经口）5000mg/kg。高浓度气体有麻醉性。有刺激性。甲苯大量用作溶剂和高辛烷值汽油添加剂，也是有机化工的重要原料，但与同时从煤和石油得到的苯和二甲苯相比，目前的产量相对过剩，因此相当数量的甲苯用于脱烷基制苯或岐化制二甲苯。甲苯衍生的一系列中间体，广泛用于染料；医药；农药；火炸药；助剂；香料等精细化学品的生产，也用于合成材料工业。甲苯进行侧链氯化得到的一氯苄；二氯苄和三氯苄，包括它们的衍生物苯甲醇；苯甲醛和苯甲酰氯（一般也从苯甲酸光气化得到），在医药；农药；染料，特别是香料合成中应用广泛。甲苯的环氯化产物是农药；医药；染料的中间体。甲苯氧化得到苯甲酸，是重要的食品防腐剂（主要使用其钠盐），也用作有机合成的中间体。甲苯及苯衍生物经磺化制得的中间体，包括对甲苯磺酸及其钠盐；CLT酸；甲苯-2,4-二磺酸；苯甲醛-2,4-二磺酸；甲苯磺酰氯等，用于洗涤剂添加剂，化肥防结块添加剂；有机颜料；医药；染料的生产。甲苯硝化制得大量的中间体。可衍生得到很多最终产品，其中在聚氨酯制品；染料和有机颜料；橡胶助剂；医药；炸药等方面最为重要。

正离子可以与酚和三级芳胺发生芳环上的亲电取代反应，生成偶氮化合物。该反应也称偶联反应，产物常用作偶氮染料。

含有重氮基（－N=N+）的盐类。干燥的重氮盐不稳定，受热或震动易爆炸，但是也有例外，也就是所谓的稳定重氮盐，例如氟硼酸重氮盐，吡唑重氮内盐以及三蝶烯重氮盐。重氮盐一般用芳香胺经重氮化制得。

反应过程是把芳香胺加入到过量浓盐酸（过量的酸的作用是防止生成的重氮盐与没有反应的芳香胺偶联，生成偶氮化合物）中，再加入适量亚硝酸钠溶液（整个反应过程需控制在0～5℃），用碘化钾淀粉试纸检验亚硝酸钠是否过量（不足需补加，过量加尿素破坏）。

脂肪胺的重氮盐极不稳定，在生成的过程中就会分解，生成醇（分解过程中经过碳正离子，会有重排现象）。