为什么反相高效液相色谱法对硝基苯酚

最简单可靠的方法就是用各种色谱法来分离。两者极性不同，它们与色谱中的流动相与固定相的相互作用也会不一样，这样就导致了它们会在色谱中流出顺序有先有后，从而达到分离的效果。

其它方法，比如可以根据二者的溶解度性质的差异，选合适的溶剂选择性地将其中一种物质溶解掉，而另一种不被溶解，也可以将他们分离。

还有，与溶剂选择性溶解相似，用重结晶的方法来进行纯化。前提是其中一种化合物的含量高于另一种化合物。具体操作可以参考大学化学实验。

所有的分离方法都是基于他们二者的化学和物理性质的差异，这些都可以通过查询相应手册得到。

纯手打，不知道是否能回答你的提问。

高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。它是在生化和分析化学中常用的柱层析仪。接下来我为大家整理了HPLC的常用术语解释，希望对你有帮助哦!

第一部分　色谱曲线

1、色谱图(chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的 方法 观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。

2、(色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出

3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线

4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。

5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离

6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。

7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积

8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。

9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)

11、畸峰(distrorted peak)：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。

12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。

13、原点(origin)：纸或薄层板上滴加试样部位的中心点

14、斑点(spot)：平面色谱法中，组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区

15、区带(zone)：在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。

16、复斑(multiple spot)：一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。

17、区带拖尾(zone tailing)：由于物理、化学等作用的影响，一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。

18、基线(base line)：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。

19、基线漂移(baseline drift)：基线随时间定向的缓慢变化。

20、基线噪声(N　，baseline noise)：由于各种原因而引起的基线波动。

21、统计矩(moment)：色谱流出曲线是组分在检测器中浓度或质量依时间的统计分布曲线，响应值对应于分布密度。组分在柱内迁移时间　r　次幂的数学期望称为流出曲线的　r　阶原点矩。而组分在柱内迁移时间与平均迁移时间差的　r　次幂的数学期望称为流出曲线的　r　阶中点矩。

22、一阶原点矩(first origin moment)：组分在柱内迁移时间的数学期望。当流出曲线为对称峰时，即为组分的保留时间。

23、二阶中心矩( μ2 ，second central moment)：二阶中心矩为流出曲线的方差。定义为：μ2=E(t-Et)2 式中，E代表平均。

24、三阶中心矩(μ3 ，third central moment)：定义为：μ3=E(t-Et)3

可以表示流出曲线的不对称程度。峰形对称时μ3=0，前伸峰μ3<0　，拖尾峰μ3>0.

第二部分　分离模式

1、液相色谱法(liquid chromatography ，LC)：用液体作流动相的色谱法。

2、液液色谱法(liquid liquid chromatography，LLC )：将固定液涂渍在载体上作为固定相的液相色谱法。

3、液固色谱法(liquid solid chromatography，LSC )：用固体(一般指吸附剂)作为流动相的液相色谱法。

4、正相液相色谱法(normal phase liquid chromatography ，NPLC)：固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。

5、反相液相色谱法(reversed phase liquid chromatography，RPLC )：固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。

6、柱液相色谱法(liquid column chromatography )：在柱管内进行组分分离的液相色谱法。

7、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC )：具有高分离效能的柱液相色谱法。

8、尺寸排除色谱法(size exclusion chromatography，SEC )：用化学惰性的多孔性物质作为固定相，试样组分按分子体积(严格来讲是流体力学体积)进行分离的液相色谱法。

9、凝胶过滤色谱法：(gel filtration chromatography )：水或水溶液作为流动相的体积排除色谱法。

10、凝胶渗透色谱法：(gel permeation chromatography ，GPC)：有机溶剂作为流动相的体积排除色谱法。

11、亲和色谱法(affinity chromatography )：用连接在基体上的配位体做固定相，使其与蛋白质或其他大分子发生可逆的高选择性的相互作用，利用不同亲和力进行分离的液相色谱法。

12、离子交换色谱法(ion exchange chromatography ，IEC)：以离子交换作用分离离子型化合物的液相色谱法。

13、离子色谱法(ion chromatography )：以含有某种特定离子的水溶液作为流动相，流出液通过抑制柱(或不通过抑制柱)，在降低流动相背景信号的条件下用于分离离子的液相色谱法。

14、离子抑制色谱法(ion suppression chromatography )：通过调节流动相的PH值来抑制试样组分的电离，以分离离子型化合物的液相色谱法。

15、离子对色谱法(ion pair chromatography )：用形成离子对化合物进行分离的液相色谱法。16、疏水作用色谱法(hydrophobic interation chromatography )：用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相，借疏水作用分离生物大分子化合物的液相色谱法。

17、制备液相色谱法(preparative liquid chromatography)：用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化合物的液相色谱法。

18、平面色谱法(planar chronatography)：在平面介质上进行组分分离的色谱法，也叫平板色谱法。

第三部分  常用术语

M：分子量

MC：二氯甲烷(methylene chloride)

MeOH：甲醇(methanol)

MS：质谱

h：峰高

HPLC：高效液相色谱

ID：内径，dC

A：吸收度(式3.1，3.2)也作面积

ACN：乙腈(acetonitrile)

B(%B)：二元流动相中的强溶剂(% v/v)

C8，C18：烷基键合相的键长度(八烷基或十八烷基)

CD：环糊精(cyclodextrin)

CV：变异系数(通常以%表示)式15.3

dC：色谱柱内径(cm)

dP：颗粒直径(μm)

DAD：二极管阵列检测器

EC：电化学(检测器)

F：流速(ml/min)

FL：荧光(检测器)

GS：梯度斜度参数(式8.2a)k*=20/GS

IEC：离子交换色谱(ion-exchange chromatography)

IPC：离子对色谱 (ion-paire chromatography)

k：保留因子(式2.4)

k*：梯度洗脱中，k的有效值或平均值(式8.1)

ka，kZ：色谱图中，首峰(a)和末峰(z)的k值

L：色谱柱长度(cm)

LC-MS：液相色谱-质谱

MTBE：甲基-叔-丁醚(methyl-t-butyl ether)

N：色谱柱塔板数(式2.82.8b)

N：噪音(式3.3，图3.3)

NARP：非水反相HPLC

NPC：正相色谱

P：色谱柱压力降(通常以psi表示)(式2.9)

pKa：酸或供质子碱的酸性常数

PAH：多环芳烃(polyaromatic hydrocarbon)

RS：分离度(式2.1)

RI：折光指数

RPC：反相色谱

S：信号式3.3图3.3以及由式6.1定义的参数

tD：延迟或滞留时间(min，用于梯度洗脱中)等于VD/F

tG：梯度时间(min)

tR：保留时间(min)(图2.2)等于tO(1+k)

tRa，tRz：色谱图中首峰(a)与末峰(z)的保留时间，tR(min)(图8.6a)

tO：色谱柱死时间(min)(式2.5)

t1，t2：相邻谱峰1与谱峰2的保留时间(min)

TEA：三乙胺(triethylamine)

THF：四氢呋喃(tetrahydrofuran)

UV：紫外光谱

VD：延迟或滞留体积(mL)为梯度混合器与色谱柱人口之间的体积(包括混合器的体积)

Vm：色谱柱死体积(mL)(式2.6)Vm为色谱柱内部的流动相体积，不包括附于固定相上的溶剂

Vmax：最大样品体积(mL)(式13.1)

Va：样品体积(mL)

w：重量(mg)也作半峰高处的峰宽(min)

wmax：不超载色谱柱的最大进样量(mg)(式2.17)

wS：色谱柱的饱和容量(mg)(式13.4)

W：峰底宽(min)(图2.2)

Wth：大进样量对峰底宽的贡献(min)(式13.2)

WO：小进样量的峰底宽(min)

W1/2：半峰高处的峰宽(min)(图1.1)

a：分离因子，等于k2/k1，其中k2与k1分别为相邻谱峰2和谱峰1的k值

△tR：tRz-tR(min)

△%B：梯度洗脱期间，%B的变化

ε：摩尔吸收系数

εo：正相HPLC 中溶剂或溶剂混合液的强度

η：粘度(CP)

<<不常有符号>>

A，B，C：式2.11中的常数数值A，B与C随k值而变化，但改变 其它 条件或溶质时基本不变

A，B，C：式2.10中的常数数值A，B与C随条件和样品而变化

A，B，C：式2.10a中的常数数值A，B与C随条件和样品而变化

C：谱峰最大值处的浓度(mol/L)

CO：注入样品中溶质的浓度(mol/L)

GI：化学电离(MS)

DGA：N，N-二甲基-1-萘酰胺(也作二甲基苯胺dimethylaniline)

EI：电子电离(MS)

ELS：蒸发光散 射击 (Evaporative light scattering)

EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)

FAB：快速原子轰击(MS)

FD：场解吸附(MS)

h：折合板高，等于H/dP(式2.11)

HB：羟基苯甲酸(hydrxybenzoic acid)(图7.8，7.17与7.19)

HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyric acid)

IPA：异丙醇(isopropanol)

kW：以水作为流动相的k值(式6.1)

LCEC：液相色谱电化学检测器

LD：激光解吸(MS)

LSIMS：液态二级离子质谱

MALDI：基质辅助激光解吸电离

MP：对羟苯甲酸甲酯

[P-]m：流动相中离子对试剂P-的浓度(mmol/L)

PAD：脉冲电流分析检测器

PBP：极性键合相

PD：等离子解吸(MS)

PP：对羟苯甲酸丙酯

PTH：乙内酰苯硫脲

R+，R-：分别为阴离子与阳离子离子交换色谱柱中的荷电功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]

RF：响应因子

TBA+：四丁基铵离子

tBME：见MTBE

TMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl也为C1)

TNB：1，3，5-三硝基苯(1，3，5-trinitrobenzene)

TOF MS：时间飞行质谱

TSP：热喷雾(MS)

u：流动相通过色谱柱的速度(cm/s)等于L/to

V：峰底宽(mL)

Vc：色谱柱内峰展宽对V的贡献也作小样品量峰底宽(mL)(式2.16)

VR：保留体积(mL)

W：峰宽(min)(式2.12)

Wc，WS，：分别为色谱柱，进样器，连续管和流通池对W的贡献(min)

Wlc，Wfc：(式2.12)

X，X1，：无特征结构的溶质(图7.8，7.17和7.19)

X2，X3

XB：流动相中的B溶剂的摩尔分数

V：折合速度，等于udp/Dm(式2.11)

б：高斯曲线的标准偏差等于峰底的1/4

ι：检测器响应时间常数(S)

φ：流动相中B溶剂的体积分数等于0.0

原理：

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相

式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。

当达平衡时：

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论：DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

操作注意要点：

1)． 首先对流动相进行过滤，根据需要选择不同的滤膜，一般为有机系和水系，常用的孔径为0.20um和0.45um。

2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)． 正常情况下，仪器首先用甲醇冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相(如流动相为缓冲试剂，则要二次重蒸水冲洗10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止) 。

4)． 一般情况下，流动相冲洗20-30分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。

5)． 同时进两针标样，将其结果相比较，其结果的比值在0.98-1.02之间后，就可以正式进行样品的测试了。

6)． 样品测试结束后，就要进行色谱仪及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓冲试剂，同样也要用重蒸水清洗10-20分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。

7)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。

8)． 填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)． 压力不能太大，最好不要超过150kgf/cm2 .

5). 因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。

常见物质官能团的极性顺序：烷基〈卤素〈（F〈 Cl〈 Br〈 I ）〈醚〈硝基〈睛〈叔胺〈酯〈酮

〈醛〈醇〈酚〈伯胺〈酰胺〈羧酸〈磺酸。

在反相液相色谱法中，物质极性强的先出峰，极性弱的后出峰，

在正相色谱中相反，物质极性强的后出峰，极性弱的先出峰。

如果知道样品组份，看化学结构式判断物质极性以及酸碱度大概就能知道了。

如果不太清楚确切组分，可以先拟定一个时间，比如有关物质通常是主峰保留时间的3-5倍。然后跑一个系统适用性，就是同一个样品，连续进样六针，如果检测过程中没有新杂质峰出现应该就算是杂质全部留出了。有新杂质出现的话可能是上一阵没有流出的杂质延续到后一针了。可以自己判断一下。