50%三氯醋酸如何配置

一、材料：各种干燥、过筛（60～80目）的植物样品。

二、仪器设备：消化管；微量凯氏定氮蒸馏装；三角烧瓶；微量滴定管；量筒；容量瓶；烧杯；移液管等。

三、植物样品中氮元素含量检测实验：

1、样品提取分离：准确称取烘至恒重的样品0.1000g～0.5000g（依样品含氮量而定，含氮1～3mg宜），置10ml离心管中，加入5ml5％三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不时搅拌。

取出后用少量蒸馏水冲洗玻棒，待溶液冷却后，4000rpm离心15min，上清液弃去。并用5％三氯乙酸洗沉淀2～3次，离心，弃去上清液，最后用蒸馏水将沉淀无损地洗入铺有滤纸的漏斗上，去掉滤液后，将沉淀和滤纸在50℃下烘干，用于蛋白氮的测定。

2、样品的消化：取4支消化管编号。1号管直接放入称好的材料用于测定总氮，2号管放入上述烘干的滤纸和沉淀，用于蛋白氮的测定，3号管放入同样滤纸一张、4号管不加任何样品作为空白对照，注意将样品放入消化管底部。

向各消化管加浓硫酸5ml，混合催化剂0.3g～0.5g，将样品浸泡数h或放置过夜后，在管口盖一小漏斗，放在远红外消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，以防止内容物上升至管口。泡沫多时，可从小漏斗加入2～3滴无水乙醇。

到管口出现白色雾状物时，泡沫已不再产生；此时可逐渐升温，使内容物达到微沸。直到消化液变为清澈透明为止。

消化过程中，若在消化管上部发现有黑色颗粒时，应小心地转动消化管，用消化液将它冲洗下来，以保证样品消化完全。消化过程约需2～3h。

3、定容消化完毕待溶液冷却后，沿管壁仔细加入10ml左右无氨蒸馏水，以冲洗管壁，再将消化液小心转入100ml容量瓶中。以无氨水少量多次冲洗消化管，洗涤液并入容量瓶。冷却后用无氨水定容至刻度，混匀备用。

4、蒸馏及滴定以下几步进行：

A、仪器的洗涤：先经一般洗涤后，还要用水蒸气洗涤。可按下列方法进行蒸气洗涤。先在蒸气发生器中加入2／3体积的蒸馏水（事先加入几滴浓硫酸，使其酸化，加入甲基红指示剂，并加入少许沸石或毛细玻璃管以防止爆沸）。

打开漏斗下的夹子，用电炉或酒精炉加热至沸腾，使水蒸气通入仪器的各个部分，以达到清洗的目的。在冷凝管下端放置一个三角瓶接收冷凝水。然后关紧漏斗下的夹子，继续用蒸气洗涤5min。

冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，蒸馏瓶中的废液由于减压而倒吸进入收集器，打开收集器下端的活塞排除废液。

如此清洗2～3次，再在冷凝管下端换放一个盛有硼酸－指示剂混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸没在液面以下0.5cm处，蒸馏1～2min，观察三瓶内的溶液是否变色。

如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去三角瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝管下口，关闭电炉，仪器即可供测定样品使用。

B、标准硫酸铵测定为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，并检验实验的准确性，找出系统误差，常用已知浓度的标准硫酸铵测试三次。

在三角瓶中加入20ml硼酸－指示剂混合液，将此三角瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加样前务必打开收集器活塞，以免三角瓶内液体倒吸。准确吸取2ml硫酸铵标准溶液，加到漏斗中。

四、结果计算：

样品中总氮量（％）＝0.010×(V3—V0)×100×14/(W×1000×10)×100×氮的回收率样品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×(V1－V2－V0)×100×14/(W×5×1000)×100×氮的回收率。

回收率（％）＝0.0100×(V－V0)×14/(2.0×0.6×100)×100。

一、药剂空白高的问题：

造成药剂空白高主要原因是过硫酸钾纯度不够。空白高于0.030，就需要提纯过硫酸钾。提纯方法就是二次结晶过硫酸钾：

1、（可以同时做两份）在1L的大烧杯中加入约800mL水，50摄氏度的水浴锅上加热（水浴锅的温度要用温度计检测下是不是正常，以免超过60摄氏度。过硫酸钾在60摄氏度以上会分解）。

我的经验是先加入90克过硫酸钾，用一滤纸盖在上面（避免污染），溶解速度慢，可以边做别的事边提纯，有空就去搅拌几下，全部溶解之后（速度较慢）。

用勺子逐渐向烧杯中加入过硫酸钾，一次不要加太多，溶了再加，直至不管怎样搅拌，隔了近一小时多都不能溶解为止（刚好有一丁点儿不能溶解），这个过程挺漫长。

2.把完全溶解的饱和溶液放在室温中自然冷却，用一干净的塑料袋包住烧杯口，并用皮筋扎紧，再放进冰箱里（调到低温度），放置一晚上，重结晶。建议同时用一个1L的广口瓶放一瓶无氨水在冰箱里冷藏（用于冲洗用）。

3.重结晶一夜后，第二天早上拿出来立即倒掉上清液，重结晶的晶体会结成一块沉在瓶底，但其实结构很松散，用钢勺什么的弄两下就离散开了，然后再清洗：用冰好的无氨水清洗几遍，尽量不要让下面的结晶流失。

4.二次结晶：清洗后的烧杯里只剩下下面的结晶，向烧杯中加入约400ML的无氨水，搅拌溶解，这次跟次结晶不同的是向烧杯中慢慢地加入无氨水，一开始可以一次稍多点水（看结晶的多少），剩下不多时要等久些，加的水也要少，直到有一丁点儿结晶不能溶解为止。

5.然后重复第2步骤（二次结晶）、第3步骤（清洗）。

6.清洗后倒掉上清液，把结晶移入一250ML的烧杯中，然后放入50摄氏度烘箱烘干即可（烘箱里的温度要用温度计检测是否正常）。烘干箱里不要放入其它物品，以免再次污染。

烘干时间较长，（我的烘了二天三夜）可以晚上放烘干箱里烘，白天放在50度水浴锅上蒸干一定。完全烘干后的药品跟原来的药品一样松散干燥，搅动会发出清脆的声音。

7．烘干后的药品从烘箱里拿出要放在干燥器里冷却一小时以上。冷却后用干净的聚乙烯瓶装好盖紧。

8.实验过程中加碱性过硫酸钾的时候一定要避免加在瓶口处。

二、总氮取水体积：

因为碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮取水样量为10ML时，测定范围为0.20mg/l7.00mg/l。总氮高于7 mg/l时要适当减少取水样量。

如果取5ML水样再稀释至10ML进行测定的话，高检出限是14 mg/l。当总氮高于14 mg/l时取水量就要再减少进行测定。我一般是取2ML水样进行测定。

出水总氮低时可以取5ML水样进行测定。吸取水样时要取静止一定时间后的上清液。

三、要用新鲜的无氨水：

整个总氮的测定过程中所用的无氨水，包括加药前稀释至10ML用的无氨水，消解后加的无氨水，以及测定吸光值时参比样用的无氨水，都必须使用同一瓶水。以免不同无氨水不同带来的误差。

四、密封事项：

比色管盖子用生料带缠好，这样密封性更好，防止氨氮跑出。

生料带对药剂没影响不会影响结果。但缠在盖子上的生料带要保持完好无损，以免碎屑掉入比色管内，影响吸光值，从而影响化验结果。比色管盖子一定要塞紧，然后用纱布和绳子扎紧。扎好后把纱布边沿往下拔，使纱布紧密包住盖子。

五、灭菌锅的温度灭菌锅的温度设定为125度，消解时间设定为1小时。

六、趁热拿出消解结束后，待灭菌锅压力降为0后，马上打开放气阀放气，放气后马上打开灭菌锅盖，立即拿出装比色管的烧杯，把总氮的比色管（压住总氮比色管的盖子）趁热多次摇匀，放回烧杯中，自然冷却。

七、加入1+1盐酸后，10分钟之后测定吸光值（只要是10分钟后就行，时间长些不要紧，但要避免污染。）。分光光度计要预热30分钟以上，测定总氮的吸光值时，要先测220波长的吸光值，全部测完了再测275波长的吸光值。

1 材料和方法

1.1 试验设计

本研究由三个试验组成：试验一设7个处理，研究纤维素酶水平（0、350、700、1050、1 400 U/g棉籽粕）对还原糖生成量、蛋白质水解度（degree of hydrolysis,DH）和三氯乙酸氮溶指数（trichloroacetic acid-nitrogen solution index ，TCA－NSI）的影响，各处理8个重复；试验二设7个处理，研究果胶酶水平（0、250、500、750、1 000 U/g棉籽粕）对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响，各处理8个重复；试验三采用2×2因子试验设计研究纤维素酶和果胶酶合用对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响：纤维素酶水平分别为350、1 400 U/g棉籽粕，果胶酶水平分别为250、1 000 U/g棉籽粕，各处理8个重复。

1.2 酶的来源和特性

本试验用的纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶为爱顿饲料有限公司生产。酶的特性见表1。

表1 酶的特性

Table 1. Character of the enzymes ℃、U/g

名称

最适pH值

最适温度

酶活力

纤维素酶

果胶酶

中性蛋白酶

4.8

5.3

7.0

45

50

50

180 000

20 000

40 000

注：AU是指LAPU是指每分钟水解1毫摩尔L-亮氨酸-对硝基苯胺即是1个单位

试验前，NSP酶用0.2 mol/L，pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，配制成浓度为500 U/mL溶液；中性蛋白酶用Ph 7.0 0.2 mol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液溶解，配制成浓度为1 000 U/mL溶液。

1.3 酶解方法

本试验用棉籽粕购自雅安圣通饲料有限责任公司。浅黄色，无酸败、霉变、焦化等异味。粗蛋白：39.53%。棉籽粕于65℃烘干，粉碎过50目，混合均匀，密封保存。称取2 g棉籽粕，加蒸馏水，使料水比为1∶6，调节pH至5.0，加入NSP酶，于温度50℃，转速120 r/min的摇床里反应5 h；然后调节pH至7.0，加入中性蛋白酶500 U/g棉籽粕，于温度50℃，转速120 r/min的摇床里反应5 h，最后升温至80℃灭酶活30 min以终止反应。

1.4 试验所用的仪器和药品

主要试剂为：硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、甲醛、氢氧化钠、过氧化氢、三氯乙酸、酒石酸钾钠、乙酸锌、冰乙酸、葡萄糖、盐酸、亚铁氰化钾、均为分析纯；主要仪器为：pHS-3C精密pH计、HZS-H水浴振荡器、90-1型恒温磁力搅拌器、电子天平。

1.5 衡量酶解效果的指标及测定方法

1.5.1 还原糖生成量：酶解产品用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀后过滤，用滤液来测定还原糖生成量。参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行。

还原糖生成量(以葡萄糖计)(%) = 酶解液中还原糖量 / 原料的重量 × 100

还原糖生成量反映细胞壁降解程度的指标。

1.5.2 DH：酶解产品用20%三氯乙酸沉淀后过滤，用滤液来测定氨基氮含量。

氨基氮含量采用甲醛滴度法测定。参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行。

DH(%) = 氨基氮含量 / 原料总氮含量 × 100

DH是反映蛋白质降解程度的指标。

1.5.3 TCA－NSI：酶解产品加入等体积的20%三氯乙酸静置后过滤，用滤液来测定氮含量。参照黄晓钰、刘邻渭(2002)[5]《食品化学综合实验》进行。

TCA-NSI(%)= 滤液中的氮 / 原料总氮含量 × 100

DH是反映蛋白质降解程度的指标。

1.5.4 原料总氮含量：采用凯氏定氮法，测定方法参照杨胜主编(1993)[6]《饲料分析及饲料质量检测技术》。

1.6 数据处理及统计分析

结果采用平均数±标准差表示；采用SPSS11.0对数据进行ANOVO方差分析、Ducan法进行多重比较和回归分析及相关分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

由表2、图1、图2知，当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕时，随着纤维素酶水平的增加，还原糖生成量、DH和TCA-NSI极显著增加(p<0.01)，当纤维素酶水平达350 U/g后，DH和TCA-NSI的增加的趋势变得缓和。

表2 纤维素酶水平对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响

Table 2. Effect of the cellulase level on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution index %

处理

纤维素酶（U/g棉籽粕）

还原糖生成

DH

TCA-NSI

1

2

3

4

5

0

350

700

1050

1400

0.51±0.00A

1.97±0.08B

3.57±0.03C

5.00±0.03D

6.30±0.03E

6.05±0.09A

7.80±0.11B

8.40±0.03C

8.71±0.07D

8.96±0.05E

33.18±0.22A

45.19±0.41B

48.17±0.49C

49.65±0.09D

51.72±0.19E

注：同列肩注不同大写字母代表差异极显著(p<0.01)；同列肩注不同小写字母代表差异显著（p<0.05）；同列肩注相同小写字母代表差异不显著（p>0.05），以下各表与此相同

图 1 纤维素酶水平对还原糖生量的影响 图 2 纤维素酶水平对DH和TCA-NSI的影响

Figure 1. Effect of the cellulase level on Figrue 2. Effect of the cellulase level on the degree of

production of reducing sugar hydrolysis,,trichloroaceticacid-nitrogen solution index

分别建立还原糖生成量(y1，%)与纤维素酶水平（x1，U/g棉籽粕）、DH（y2，%）与纤维素酶水平（x2，U/g棉籽粕）、 TCA-NSI（y3，%）与纤维素酶水平（x3，U/g棉籽粕）的二次回归方程：

y1=0.476274A＋0.004569Ax1―2.797813E-07Ax12 (p<0.01，R2＝1.00)

y2＝6.146831A＋0.004589Ax2―1.887373E-06Ax22 (p<0.01，R2＝0.98)

y3=33.984518A＋0.029905Ax3―1.277471E-05Ax32 (p<0.01，R2＝0.96)

系数肩注A代表—极显著（p<0.01）。

当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕，酶解时间为5 h时，y1方程寻优求得：纤维素酶的最优水平为2 165.3 U/g棉籽粕，还原糖生成量为9.13%；y2方程寻优求得：纤维素酶最优水平为1 215.7 U/g棉籽粕，DH为8.94%；y3方程寻优求得：纤维素酶最优水平为1 170.5 U/g棉籽粕，TCA-NSI为51.49%。

进行相关分析：DH和TCA-NSI与还原糖生成量之间、DH与TCA-NSI之间的相关系数分别为0.922（p<0.01），0.887(p<0.01)，0.997(p<0.01)。

2.2 果胶酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

由表3，当中性蛋白酶水平为500U/g棉籽粕时，随着果胶酶水平的增加，还原糖生成量和TCA-NSI极显著增加（p<0.01）、DH显著增加（p<0.05）。由图3、和图4知，当果胶酶水平达250U/g后，还原糖生成量和TCA-NSI呈极显著增加(p<0.01)，DH呈显著增加（p<0.05），但是DH和TCA-NSI增加的量很小。

表3 果胶酶水平对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响

Table 3. Effect of the pectinase level on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution indexU/g、%

处理

果胶酶

还原糖生成量

DH

TCA-NSI

1

2

3

4

5

0

250

500

750

1000

0.52±0.00A

3.39±0.03B

4.58±0.04C

5.63±0.07D

6.30±0.03E

5.53±0.15Aa

6.06±0.15Bb

6.44±0.14Cc

6.71±0.09CDd

6.92±0.13De

32.50±0.27A

34.11±0.18B

36.10±0.19C

37.56±0.21D

38.44±0.16E

注：同上

图 3 果胶酶水平对还原糖生成量的影响 图 4 果胶酶水平对DH和TCA-NSI的影响

Figure 3. Effect of the pectinase level Figure 4. Effect of the pectinase level on

on the production of reducing sugar the degree of hydrolysis and trichloroacetic

acid-nitrogen solution index

分别建立还原糖生成量(y1，%)与果胶酶水平（x1，U/g棉籽粕）、DH（y2，%）与果胶酶水平（x2，U/g棉籽粕）、TCA-NSI（y3，%）与果胶酶水平（x3，U/g棉籽粕）的二次回归方程：

y1=0.657481A+0.010465Ax1-4.770212E-06Ax12 (p<0.01，R2＝0.99)

y2=5.542136A+0.002211Ax2-8.461610E-07Ax22 (p<0.01，R2＝0.95)

y3=32.493079A+0.008714Ax3-2.737430E-06Ax32 (p<0.01，R2＝0.99)

系数肩注A代表—极显著(p<0.01)。

当中性蛋白酶水平为500 U/g棉籽粕，酶解时间为5 h时，y1方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 096.9 U/g棉籽粕，还原糖生成量为6.40%； y2方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 306.5 U/g棉籽粕，DH为6.98%；y3方程寻优求得：果胶酶最优水平为1 519.6 U/g棉籽粕，TCA-NSI为39.43%。

进行相关分析：DH和TCA-NSI与还原糖生成量之间、DH与TCA-NSI之间的相关系数分别为：0.971（p<0.01）、0.972（p<0.01）和0.944(p<0.05)。

2.3 纤维素酶和果胶酶合用对蛋白酶酶解效果的影响

由表4知，在高低果胶酶水平上，还原糖生成量、DH和TCA-NSI随着纤维素酶水平的增加而极显著增加(p<0.01)。同样，在高低纤维素酶水平上，还原糖生成量、DH和TCA-NSI随着果胶酶水平的增加而极显著增加(p<0.01）。而各处理间还原糖生成量、DH和TCA-NSI差异极显著（p<0.01）。

表4 纤维素酶和果胶酶合用对还原糖生成量、DH和TCA-NSI的影响

Table 4. Effect of the cellulase and pectinase on the production of reducing sugar ，degree of hydrolysis and trichloroacetic acid-nitrogen solution index %

处理

纤维素酶

(U/g棉籽粕)

果胶酶

(U/g棉籽粕)

还原糖生成量

DH

TCA-NSI

1

2

3

4

350

350

1400

1400

250

1000

250

1000

4.93±0.01A

10.55±0.18B

11.40±0.12C

15.50±0.19D

8.19±0.11A

10.16±0.14B

11.09±0.07C

13.62±0.17D

47.01±0.50A

51.10±0.19B

57.69±0.27C

62.00±0.56D

注：同上

对各因素进行重要性分析，各因素的重要性见表5。就还原糖生成量而言，纤维素酶>果胶酶>纤维素酶X果胶酶。就对DH的贡献而言，纤维素酶>果胶酶>纤维素酶X果胶酶。就TCA-NSI的贡献而言，纤维素酶>果胶酶,两者无交互作用。

进行相关分析：DH和TCA-NSI与还原糖生成量之间、DH与TCA-NSI之间的系数分别为：0.980（p<0.01）、0.934（p<0.01）和0.960(p<0.05)。

表5 因素重要性分析

Table 5. Importance analysis of the factors %

因素

贡献率

还原糖生成量

DH

TCA-NSI

纤维素酶

果胶酶

纤维素酶X果胶酶

6.70

4.92

0.12

2.10

1.02

0.01

0.95

0.14

无互作关系

3 讨论

3.1 NSP酶种类对还原糖生成量的影响

棉籽粕中主要的NSP是纤维素、果胶、阿拉伯木聚糖等。本试验发现，单独用纤维素酶或果胶酶与中性蛋白酶合用均可极显著提高酶解棉籽粕的还原糖生成量，说明这两种酶可以有效地降解纤维素和果胶生成还原糖，这与何中山（2004）[7]在豆粕上的研究有相似之处。何中山（2004）[7]研究发现，就还原糖释放而言，纤维素酶、果胶酶和甘露聚糖酶都极显著提高了还原糖生成量。

本试验发现，与添加果胶酶相比，添加纤维素酶，还原糖生成量平均降低0.765%,降低了18.8%，表明果胶酶优于纤维素酶。

通过2×2因子试验发现，同时添加纤维素酶和果胶酶具有协同作用，可提高还原糖生成量；且存在交互作用，表现为在纤维素酶水平低时，提高果胶酶水平对还原糖生成量的提高程度大于纤维素酶水平高时；同样，在果胶酶水平低时，提高纤维素酶水平对还原糖生成量的提高程度大于果胶酶水平高时。

3.2 NSP酶种类对蛋白酶酶解效果的影响

本试验发现，纤维素酶或果胶酶与中性蛋白酶合用可进一步提高中性蛋白酶对棉籽粕蛋白的水解程度。目前关于NSP酶对蛋白酶水解效果影响的研究报道较少，本试验结果与一些研究报道相似。高红岩等（2004）[8]研究发现豆粕经纤维素酶处理之后，水溶性氮增加了60.03%，再用蛋白酶处理可进一步提高蛋白质的溶出率。魏述众等(1999)[9]果胶酶水解豆粕能增加豆粕蛋白质浸出率。纤维素酶对蛋白酶水解植物蛋白的影响还受纤维素酶加入顺序的影响。王金华和夏服宝(2003)[10]研究发现木瓜蛋白酶单酶水解蚕蛹蛋白的氨态氮与总氮比值为0.51，与纤维素酶共同水解蚕蛹蛋白的氨态氮与总氮比值根据加入纤维素酶的先后顺序而不同：当先加入纤维素酶、后加入木瓜蛋白酶与同时加入纤维素酶和木瓜蛋白酶，水解蚕蛹蛋白的氨基氮和总氮比值分别为0.62和0.60；而当先加入木瓜白酶，再加纤维素酶与单独用木瓜蛋白酶酶解的比值间没有显著性差异(p<0.05)，表明纤维素酶的加入对木瓜蛋白酶酶解蚕蛹蛋白有明显的促进作用(p<0.05),可以提高水解液中9%～11%的氨基氮含量。李树品等(1997)[11]研究发现，NSP酶对蛋白酶水解棉籽蛋白程度的贡献受蛋白酶水平的影响。在用低水平的166蛋白酶（8 000U/g豆粕），或1 398蛋白酶（9 000 U/g豆粕）单独水解豆粕时72 h，不同水平纤维素酶对蛋白质消化率的作用效果不存在明显的差异；但是当提高166蛋白酶用量到20 000 U/g豆粕时，纤维素酶水平为15～20 U/g豆粕，显著出了效果(李树品等，1997)[11]。何中山（2004）[7]研究发现，当中性蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）时，高低水平NSP酶之间的DH和TCA-NSI差异极显著（p<0.01），而当中性蛋白酶在高水平（1 000、1 500、2 000 U/g豆粕）时，高低水平NSP酶之间的DH和TCA-NSI无显著差异（p>0.05）。因此，关于纤维素酶对蛋白酶水解植物性原料蛋白的影响可能与蛋白酶水平有关。具体原因尚需进一步研究。

本试验研究发现纤维素酶和果胶酶具有协同作用，可提高蛋白质水解度，且存在交互作用，表现在纤维素酶水平低时，提高果胶酶水平，蛋白质水解度的提高程度大于在纤维素酶水平高时；在果胶酶水平低时，提高纤维素酶水平，蛋白质水解度的提高程度大于在果胶酶高时。目前关于NSP酶联合应时是否对植物蛋白水解的贡献存在交互作用研究报道较少。刘志强和邓光炳(1999)[12]进行比较发现，成分单一的纤维素酶对提高出油率及蛋白质得率效果不大，而当用NOVO公司的纤维素酶（一种以纤维素酶为主体包含有半纤维素酶、果胶酶组成的混合酶系）能很快使植物细胞壁分解崩溃，且有利于细胞内油脂复合体的释出和降解，表明，复合酶更能有效提高酶解效果，原因可能是：NSP酶水解植物细胞壁存在明显的交互作用，因此，经蛋白酶作用之后，也可能存在明显的交互作用。由于目前在这方面的研究报道较少，具体原因尚需进一步研究。

纤维素酶和果胶酶单独作用或二者合用均可提高蛋白酶酶解棉籽粕蛋白的程度，NSP酶提高蛋白酶水解棉籽蛋白的原因可能是：1)NSP酶作用于细胞壁，使细胞壁部分降解，破坏细胞壁的结构，纤维素中破坏，释放出碳水化合物和蛋白质，然后再在蛋白酶的作用下进一步降低，通过蛋白酶的作用达到蛋白质水解的效果(高红岩，2004)[8]。且本试验无论先分别单独使用纤维素酶和果胶酶或二者合用时，还原糖生成量极显著提高，且还原糖生成量与DH和TCA-NSI存在极显著的正相关，这就说明存在这种可能性。

本试验比较纤维素酶（适宜水平350U/g棉籽粕）和果胶酶（适宜水平250U/g棉籽粕）在适宜酶水平（酶解时间均为5小时）时的水解效果发现，纤维素酶水解的还原糖生成量低41.89%、DH提高28.71%、TCA-NSI提高32.17%和成本提高7.70%。与单用果胶酶比较，双酶合用时还原糖生成量、DH和TCA-NSI分别提高39.53%、 35.15%、37.82%,成本提高107倍。因此，以DH和TCA-NSI为标识，双酶合用>纤维素酶>果胶酶；成本：双酶合用>纤维素酶>果胶酶,综合考虑成本和对DH和TCA-NSI的贡献，推荐用纤维素酶先水解棉籽粕，再用蛋白酶（500 U/g棉籽粕水解）。

3.3 NSP酶水平对蛋白酶酶解效果的影响

本试验发现，单独使用纤维素酶或果胶酶水解棉籽粕时，都能进一步提高中性蛋白酶水解棉籽粕产物的DH和TCA-NSI，且DH和TCA-NSI与纤维素酶水平、果胶酶水平呈二次曲线规律，随着纤维素酶水平增加而增加，当纤维素酶水平达350 U/g棉籽粕以后，DH和TCA-NSI增加的趋势变得缓和（见图2）。因此，以DH和TCA-NSI为标识，确定纤维素酶的适宜水平为350U/g棉籽粕。随着果胶酶水平增加，DH和TCA-NSI仍增加；但是总的来说，果胶酶水平对DH和TCA-NSI的影响较小，因此，为了节约经济成本，确定果胶酶的适宜水平为250U/g棉籽粕。

纤维素酶和果胶酶合用时，极显著提高中性蛋白酶水解棉籽粕蛋白的DH和TCA-NSI（见表4），而且随着纤维素酶和果胶酶合用时水平的增加，DH和TCA-NSI极显著性增加。何中山(2004)[7]在豆粕上的研究报道与本试验结果有相似之处。何中山(2004)[7]在豆粕上研究发现，当蛋白酶在低水平（500 U/g豆粕）时，NSP酶合用时，随着NSP酶水平的增加，能极显著提高低水平中性蛋白酶水解豆粕蛋白的DH和TCA-NSI。纤维素酶和果胶酶合用时，纤维素酶或果胶酶水平的提高可提高蛋白质水解程度，存在交互作用：在纤维素酶水平低时，提高果胶酶水平，蛋白质水解度的提高程度小于纤维素酶水平高时；在果胶酶水平低时，提高纤维素酶水平，蛋白质水解度的提高程度小于果胶酶低时。分析原因可能是：随着NSP酶水平的增加，破坏细胞壁越多，释放出蛋白质越多，按酶促动力学反应，经蛋白酶作用后，蛋白水解程度增加。目前未见有关于NSP酶合用时不同NSP酶水平适宜组合对蛋白酶水解蛋白程度的研究报道，具体原因尚需进一步研究。

本试验以DH和TCA-NSI为标识，确定纤维素酶和果胶酶合用时的适宜水平为：纤维素酶350U/g棉籽粕，果胶酶250 U/g棉籽粕，酶解产品中的还原糖生成量为4.93%、DH为8.19%、TCA-NSI为47.01%。

4 结论

在先用NSP酶水解5 h，然后用中性蛋白酶500 U/g棉籽粕水解5 h时，单独使用纤维素酶或果胶酶均可提高蛋白质水解度和三氯乙酸氮溶指数，适宜水平分别为：纤维素酶350 U/g棉籽粕，果胶酶250 U/g棉籽粕；同时使用纤维素酶和果胶酶，对提高蛋白质水解度具有协同效应，适宜水平为：纤维素酶350 U/g棉籽粕和果胶酶250 U/g棉籽粕。

一、原理

植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮；通常只测定总氮或蛋白氮。将植物材料与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。

蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量，（约在14％～18％，平均约含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白质的含量。若以总氮含量乘以6.25，就是样品的粗蛋白含量。试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠粉使硝基水杨酸转化为铵盐。由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：各种干燥、过筛（60～80目）的植物样品

（二）仪器设备：1. 消化管；2. 微量凯氏定氮蒸馏装置一套（图17）；3. 三角烧瓶；4.微量滴定管；5. 量筒；6. 容量瓶；7. 烧杯；8. 移液管等。

三、实验步骤

（一）样品提取分离：准确称取烘至恒重的样品0.1000g～0.5000g（依样品含氮量而定，含氮1～3mg宜），置10ml离心管中，加入5ml5％三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不时搅拌，取出后用少量蒸馏水冲洗玻棒，待溶液冷却后，4000rpm离心15min，上清液弃去。并用5％三氯乙酸洗沉淀2～3次，离心，弃去上清液，最后用蒸馏水将沉淀无损地洗入铺有滤纸的漏斗上，去掉滤液后，将沉淀和滤纸在50℃下烘干，用于蛋白氮的测定。

（二）样品的消化：取4支消化管编号。1号管直接放入称好的材料用于测定总氮，2号管放入上述烘干的滤纸和沉淀，用于蛋白氮的测定，3号管放入同样滤纸一张、4号管不加任何样品作为空白对照，注意将样品放入消化管底部。向各消化管加浓硫酸5ml，混合催化剂0.3g～0.5g，将样品浸泡数h或放置过夜后，在管口盖一小漏斗，放在远红外消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，以防止内容物上升至管口。泡沫多时，可从小漏斗加入2～3滴无水乙醇。到管口出现白色雾状物时，泡沫已不再产生；此时可逐渐升温，使内容物达到微沸。直到消化液变为清澈透明为止。消化过程中，若在消化管上部发现有黑色颗粒时，应小心地转动消化管，用消化液将它冲洗下来，以保证样品消化完全。消化过程约需2～3h。

（三）定容消化完毕待溶液冷却后，沿管壁仔细加入10ml左右无氨蒸馏水，以冲洗管壁，再将消化液小心转入100ml容量瓶中。以无氨水少量多次冲洗消化管，洗涤液并入容量瓶。冷却后用无氨水定容至刻度，混匀备用。

（四）蒸馏及滴定 以下几步进行：

1.仪器的洗涤：先经一般洗涤后，还要用水蒸气洗涤。可按下列方法进行蒸气洗涤。先在蒸气发生器中加入2／3体积的蒸馏水（事先加入几滴浓硫酸，使其酸化，加入甲基红指示剂，并加入少许沸石或毛细玻璃管以防止爆沸）。打开漏斗下的夹子，用电炉或酒精炉加热至沸腾，使水蒸气通入仪器的各个部分，以达到清洗的目的。在冷凝管下端放置一个三角瓶接收冷凝水。然后关紧漏斗下的夹子，继续用蒸气洗涤5min。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，蒸馏瓶中的废液由于减压而倒吸进入收集器，打开收集器下端的活塞排除废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下端换放一个盛有硼酸－指示剂混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸没在液面以下0.5cm处，蒸馏1～2min，观察三瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去三角瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝管下口，关闭电炉，仪器即可供测定样品使用。

2.标准硫酸铵测定为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，并检验实验的准确性，找出系统误差，常用已知浓度的标准硫酸铵测试三次。在三角瓶中加入20ml硼酸－指示剂混合液，将此三角瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加样前务必打开收集器活塞，以免三角瓶内液体倒吸。准确吸取2ml硫酸铵标准溶液，加到漏斗中。

四、结果计算

样品中总氮量（％）＝0.010×（V3—V0）×100×14/（W×1000×10）×100×氮的回收率

样品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×（V1－V2－V0）×100×14/（W×5×1000）×100×氮的回收率

回收率（％）＝0.0100×（V－V0）×14/（2.0×0.6×100）×100