丙二酸是什么

1、可由丙二酸与氢氧化钠溶液中和而得。

2、工业生产常将氯乙酸与氰化钠反应，生成氰乙酸，然后再经液碱作用得到丙二酸钠。将氯乙酸溶解于水中，在15℃以下用饱和碳酸钠溶液中和至pH7.0，然后于45℃加入氰化钠溶液，于105至110℃反应30min，加入45-55%氢氧化钠，在100-105℃反应1.5h，溶液浓缩干燥得丙二酸钠。

丙二酸钠是三羧酸循环的抑制剂，一个TCA循环可以合成36个ATP，是合成ATP的主要步骤，而细胞质流动时需要消耗能量的。用丙二酸钠处理后的细胞由于ATP合成量的减少，而导致细胞质流动减慢至停止

如未加特殊说明,本实验所用溶液的浓度表示法均为百分浓度W/V.

实验一 转氨酶GPT活性的测定

【 原 理 】

转氨酶是体内重要的一类酶.转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这种作用称为转氨基作用.它在生物体内蛋白质的合成,分解等中间代谢过程中,在糖,脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系,相互制约及相互转变上都起着很重要的作用.

在动物机体中活力最强,分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-Oxaloacetate transaminase简称GOT),另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase简称GPT).本实验以谷氨酸丙酮酸转氨酶为例.它的催化反应如下:

GPT

丙氨酸 + α–酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸

37℃

由上可见此反应最终产物是丙酮酸.测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性.

丙酮酸可与2,4–二硝基苯肼反应,形成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,显色的深浅在一定范围内可反映所生成的丙酮酸量多少,与同样处理的丙酮酸标准液进行比色,计算出其含量,以此测定转氨酶的活性.

丙酮酸 + 2,4–二硝基苯肼 丙酮酸–2,4–二硝基苯腙(棕红色)

本实验用金氏(King)法(1)测定转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60分钟,生成1μmol丙酮酸为1个单位.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液:

甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g(或Na2HPO4 · 12H2O 23.87g)溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

乙液:1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

取甲液825 ml乙液175 ml混合,测其pH为7.4即1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液.

2.GPT基质液:精确称取a–酮戊二酸29.2 mg及DL–丙氨酸1.78g,溶于1/15 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液50ml 中溶解,加1mol/L NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4.再以pH 7.4的磷酸缓冲液定容至100ml,充分混合,冰冻贮存.

3.2,4–二硝基苯肼溶液:精确称取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶解于10ml浓盐酸中(可加热助溶),再以蒸馏水稀释至100ml(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存.(注意:此溶液配制时释放大量的热和难闻气味配制时应戴上口罩)

4.丙酮酸标准液(1ml = 2μmol丙酮酸即2mmol/L):精确称取丙酮酸钠22mg于100ml容量瓶中,用1/15 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度.此溶液应新鲜配制,不能存放.

5.0.4 mol/L氢氧化钠溶液:称取16g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 000ml.

6.1mol/L氢氧化钠溶液:称取4g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 00ml.

7.血清300ml.

二 器材

1.水浴锅.

2.分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线制作:取6支试管按下表操作.

试管号

试 剂

1 2 3 4 5 6

丙酮酸标准液 (ml)

GPT基质液 (ml)

PH7.4磷酸缓冲液(ml)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

水浴37℃,10分钟

2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

保温37℃,20分钟

0.4N氢氧化钠溶液 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500

混匀后,用分光光度计在520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取各管吸光度读数.以各管相应的转氨酶活性单位值为横坐标,吸光度值为纵坐标,用坐标纸绘制标准曲线.

2.GPT测定:取2支洁净的试管按下表操作.

试 剂 空 白 测 定

血 清 (ml) 0.1 0.1

G PT基质液 (ml) -- 0.5

混匀, 37℃水浴,60分钟

G PT基质液 (ml) 0.5 --

2,4二硝基苯肼溶液 (ml) 0.5 0.5

混匀, 37℃水浴,20分钟

0.4mol/L氢氧化钠 (ml) 5.0 5.0

混匀,放置5分钟,用分光光度计在波长520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取测定管吸光度值.

【 实验结果 】

所测得的吸光度值在已绘制好的标准曲线上直接查对,即可得知待测转氨酶的活性单位.

【 注意事项 】

1.测定血清中转氨酶活性主要有金氏 (King) 法,赖氏 (Reitman—Frankel)法和改良穆氏(Mohun)法.这三种方法的原理,试剂和操作方法包括血清和试剂的用量及作用温度均相同,不同之处是金氏法酶作用时间为60分钟,而其他二法为30分钟.因此活性单位定义不同.

2.转氨酶只作用于L–型氨基酸,对D–型氨基酸无催化能力.实验中所用的是DL–型的混旋氨基酸.若采用L–型时,则用量比DL–型少一半.

3.所用仪器应清洁,不应含有酸,碱,Zn2+,Ca2+,Hg2+,Ag+等蛋白沉淀剂.

4.血清不应溶血,因血细胞内转氨酶含量较多.样品采集后应当日进行测定,否则应将血清分离后贮存于冰箱.

5.温度及时间一定要严格控制,准确掌握.pH要准确以免影响酶活性.

实验二 过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

【 原 理 】

在生物机体内,某些代谢物由于需氧脱氢的结果而产生对机体有害的过氧化氢.体内的过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧,使过氧化氢不致在体内积累.因此,过氧化氢酶具有保护生物机体的作用.

过氧化氢酶是一种以铁卟啉为辅基的酶,它广泛存在于动植物组织中.

过氧化物酶也是一种以铁卟啉为辅基的酶,它能催化过氧化氢释放出新生态氧以氧化某些酚类和胺类物质,例如,氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙(橙红色).其作用机制如下:

E + H2O2 E–H2O2

E–H2O2 + H2O2 E + 2 H2O + O2

【 试剂和器材 】

一 试剂

2%过氧化氢溶液:此溶液易见光分解,应新鲜配制.

1%焦性没食子酸溶液:焦性没食子酸1g,用蒸馏水溶解并配至100ml.此溶液易

氧化,应新鲜配制.

铁粉.

二 材料

鲜猪肝糜.

马铃薯或血液.

白菜梗提取液:白菜梗约5g,切成细块,置研钵内,加蒸馏水15ml研磨成浆,转

移出滤液,备用.

【 操 作 】

1.过氧化氢酶的作用

取试管5支,按下表操作:

试管 2% H2O2(ml) 新鲜肝糜 (g) 煮沸肝糜(g) 生马铃薯(g) 熟马铃薯(g) 铁粉

1 3 0.5 - - - -

2 3 - 0.5 - - -

3 3 - - 1 - -

4 3 - - - 1 -

5 3 - - - - 少许

加毕,观察有无气泡放出,特别是肝糜周围和马铃薯周围.

2.过氧化物酶的作用

取试管4支,按下表操作:

试管 1%焦性没食子酸 2% H2O2 蒸馏水 白菜梗提取液 煮沸的白菜梗提取液

(ml) (滴) (ml) (ml) (ml)

1 2 2 2 - -

2 2 - - 2 -

3 2 2 - 2 -

4 2 2 - - 2

摇匀后,观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现.

实验三 琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用

【 原 理 】

琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶,测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定

三羧酸循环途径是否存在.琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢,产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水.在缺氧的情况下,若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用.如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白.这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用.

琥珀酸 + 甲烯蓝 琥珀酸脱氢酶 延胡索酸 + 甲烯白

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合.若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制.如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1.5%琥珀酸钠溶液:取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后,以氢氧化钠溶液中和至pH7~8.

2.1%丙二酸钠溶液:取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.

3.0.02%甲烯蓝溶液.

4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.88g,用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml.

5.液体石蜡.

二 器材

1.玻璃匀浆器.

2.离心机.

三 材料

新鲜猪心.

【 操 作 】

1.猪心脏制备液:称取新鲜猪心1.5~2.0g玻璃匀浆器放中,加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,捣碎成浆,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置一小时,不时摇动,离心(3000r/min 10 min)取上清液备用.

2.取4支试管,编号并按下表操作:

试管 心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液 1%丙二酸钠溶液 蒸馏水 0.02%甲烯蓝溶液

(滴) (滴) (滴) (滴) (滴)

1 5 5 - 10 2

2 5(先煮沸) 5 - 10 2

3 5 5 5 5 2

4 5 10 5 5 2

3.各管溶液混匀后,每管各加液体石蜡一薄层(约5~10滴).为什么

4.各管置于37℃水浴中,半小时内观察各管颜色变化,比较其速度并说明原因.然后将第一管用力摇动,观察其有何变化 为什么

实验四 γ–球蛋白的分离

【 原 理 】

中性盐 (如硫酸铵,硫酸钠,氯化钠,硫酸镁等)对球状蛋白质的溶解度有显著影响.随着中性盐浓度的增加,离子强度也增加.当溶液离子强度增加到一定数值时,溶液中蛋白质的溶解度开始下降.离子强度增加到足够高时,蛋白质可从水溶液中沉淀出来,这种现象叫做盐析.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质.

蛋白质是一种生物大分子,它具有不能通过半透膜的性质.透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐,单糖等分开.本次实验应用的是脱盐透析,即盐析后,将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内,再将透析袋浸入蒸馏水中.经过一段时间,袋内的盐类浓度即逐渐降低.若经常更换袋外的液体,最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净,从而达到脱盐的目的.应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α,β球蛋白分离,最后用透析法脱盐,即可得到纯度较高的γ–球蛋白.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.pH 7.2,0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水(简称PBS): 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml,0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.

2.pH7.2饱和硫酸铵溶液:用浓氨水将2 000ml饱和硫酸铵溶液调pH到7.2.

3.纳氏试剂:

纳氏试剂贮存液:于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克,碘110克,汞50克及蒸馏水l00ml,用力振荡7~15分钟,至碘色将转变时,此混合液即产生高热.随即将此烧瓶浸于冷水内振荡,直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止.将上清液倾入2 000ml量筒内,并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次.将洗涤液一并倾入量筒内,加蒸馏水至2 000ml刻度后,混匀即成.

纳氏试剂应用液:取10%氢氧化钠700ml,钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成,如显混浊,可静置数日后取上清液使用.此试剂之酸碱度极为重要.用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时,需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜.否则必须纠正其酸碱度.

4.双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(NaKC4H406 · 4H20)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂以石蜡的瓶中,可长期保存.

5.浓蔗糖液:蔗糖的饱和溶液.

6.10%氢氧化钠:取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至100ml.

二 器材

1.透析袋.

2.磁力搅拌器.

3.离心机.

三 材料

兔血清

【 操 作 】

一 盐析

1.取离心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀释血清,摇匀后,逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml(相当于33%饱和度硫酸铵),边加边摇.然后静止半小时,再离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含白蛋白).

2.用lml PBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解,再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1.摇匀后放置半小时,离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含α,β球蛋白),其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白.如要得到更纯的γ–球蛋白,可重复盐析过程1～2 次.

3.把提取的γ–球蛋白用1 mlPBS悬浮.

二 透析脱盐与浓缩

1.将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内,用线绳缚紧上口,用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中,使透析袋下半部浸入水中.

2.将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上(中间换水1～2次),然后将透析袋取下.小心将线绳解开,吸取袋内的液体,与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质,用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子(NH4+),观察透析法的脱盐效果.

3.脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩,即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上,观察袋内液体体积的变化.

实验五 γ–球蛋白含量测定(光度分析法)

【 原 理 】

双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种,是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法.因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应.在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关.在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.标准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05mol/L NaOH溶液配制:5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml.

2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜(CuSO4 · 5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6 · 4H2O)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂有石蜡的瓶中,可长期保存.

3.未知蛋白质溶液:γ–球蛋白溶液.

二 器材

分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线的绘制:取6支试管按下表操作.

试 剂 1 2 3 4 5 6

标准酪蛋白溶液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 (ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4 4 4 4

室温下(15~25℃)放置30分钟,用分光光度计于540nm测定.以光密度为纵坐标,酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线.

2.γ–球蛋白溶液浓度的测定:取3支试管按下表操作.

试 剂 空白管 测定1 测定2

γ–球蛋白溶液(ml) - 1 1

蒸馏水 (ml) 2 1 1

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4

摇匀,放置30分钟,540nm测定读取光密度.

【 实验结果 】

求出待测蛋白质溶液的光密度后,从标准曲线上查出其蛋白质浓度,按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量.

实验六 凝胶柱层析法(γ–球蛋白纯化)

【 原 理 】

凝胶层析(gel chromatography),又称为凝胶过滤(gel filtration),分子筛过滤(molecular sieve filtration),凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等.它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术.其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的方法.

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构.网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态.人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼,小于筛眼的物质分子均可通过,大于筛眼的物质分子则不能,故称为"分子筛".凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长,阻力大,流速慢大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短,阻力小,流速快,比小分子先流出层析柱小分子最后流出.分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子,则居中流出.这样被分离物质即被按分子的大小分开.

用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品,主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex),琼脂糖(商品名为Sepharose),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物.

本实验主要介绍葡聚糖凝胶,这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2,3–环氧丙烷 (CH2—CH—CH2C1)交连而成.环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来,凝

\/

O 胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例(交联度)来控制.

葡聚糖具有较强的亲水性,在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶,其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系.交联度大的,孔径小,吸水少,膨胀的程度小交联度小的,孔径大,吸水多,膨胀的程度大.因此,葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示,常以G–10至G–200号码标记.G后面的数字是其吸水量(毫升水/克干胶)乘以10所得的值.如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶.市售有G–10,G–25,G–50,G–75,G–100,G–150,G–200等型号.G–75以上的胶因吸水量大,膨胀后形态柔软易变,统称为软胶.G–75以下的称为硬胶.

葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万.可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用.一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及"脱盐".Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质.

凝胶层析是一种物理分离法.葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性,不与被分离物质发生反应,所以分离的效果较好.然而由于它是葡萄糖的聚合物,因而仍有少量活性羟基,能吸附少量蛋白质等被分离的物质.为了克服这个缺点,一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液.

本实验采用凝胶过滤法纯化γ–球蛋白,除去其中的硫酸铵,以达到纯化目的.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.实验二提取出的γ–球蛋白

2.磷酸盐缓冲液(pH6.7,0.0175mol):取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml,0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合,用蒸馏水稀释至1 000ml.

3.Sephadex G–25.

4.奈氏试剂

5.20%磺酰水扬酸

6.洗脱液:磷酸盐缓冲液(pH 7.0,0.01mol) 取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5ml,0.2mol /LNaH2PO4溶液19.4ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.

二 器材

1.lcm×20cm层析柱

2.洗脱瓶.

3.部分收集器

恒流泵

5.监测仪

【 操 作 】

1.凝胶处理:溶胀(水化):商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒,使用前必须水化溶胀.商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用,玻璃球不用溶胀.

凝胶溶胀有两种方法:一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀另一种 是置于沸水浴中溶胀.各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见实验原理部分.

必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀.两种方法中,沸水浴溶胀不但节省时间,还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼.

凝胶溶胀后,需用蒸馏水洗涤几次,每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去,以免在装柱后产生阻塞现象,降低流速.洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用.

一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算:称取1g所需型号的葡聚糖干胶,放在5ml量筒中,用室温溶胀的方法充分溶胀,观察溶胀后凝胶的体积.然后在层析柱中加水到所需柱床高度,将水倒出,量取柱床体积.根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积,即可推算出干胶的需要量.

2.装柱 将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法.作层析用的柱子称层析柱.层析柱有玻璃和透明塑料的两种.柱子的一端为进口,另一端为出口,出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布,能阻止层析剂流出,溶剂则可流过.如果没有市售的层析柱,可以选用粗细均匀,长短合适的玻璃管,在两端塞上合适的胶塞,胶塞中插人细玻璃管,在一端放一层尼龙布为出口,即可作为层析柱使用.层析柱的长短粗细根据实验的目的而定,一般说来,凝胶层析时柱越长,分离效果越好.但柱过长,层析时间长,样品易稀释造成扩散,反而影响分离效果.柱的内径不宜较细,直径1cm以下的柱易发生"管壁效应",即柱中部分的物质组分移动较快,管壁周围的则移动较慢,造成分离混乱.当然柱的内径也不宜过粗.

凝胶层析中,在把小分子物质(mw<1 500),如无机或其他物质与大分子物质 (mw0.5ml/支).

配制测定试剂:1号试剂:2号试剂:3号试剂=1.0:0.1:0.1,混匀.临用前视需要量配制,现用现配.

二 器材

1.水浴锅

2.分光光度计

三 材料

血清

【 操 作 】

试剂测定管(U) 标准管(S) 空白管(B)

血清 (μl)(1:5) 30 – –

标准液 (μl) – 30 –

测定试剂 (ml) 0.6 0.6 0.6

蒸馏水 (ml) 0.25 0.25 0.28

4号应用液(ml) 0.15 0.15 0.15

充分混匀,置37℃水浴30分钟

显色剂 (ml) 1.0 1.0 1.0

血清(1:5):0.1ml+0.4ml生理盐水1:5稀释后使用.

混匀,室温10分钟后,分光光度计550nm,1cm厚度比色杯比色,用蒸馏水调零.

酶活性单位表示:SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位.结果以每毫升酶单位表示.

【 实验结果 】

SOD U/ml = B-U/B-S×33.3×标准液体积/样品的体积

=B-U/B-S×33.3×30/30×1000/5000

=B-U/B-S×167

正常参考值:人血清SOD:59.5±17.1U/ml(血清取样量6μl)

实验十七 等电聚焦法测定SOD等电点

【 原 理 】

等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质,当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度,当蛋白质放进此体系时,不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上.等电聚焦的优点是:有很高的分辨率,可将等电点相差0.01-0.02 pH单位的蛋白质分开一般电泳由于受扩散作用的影响,随着时间和所走的距离加长,区带越走越宽,而等电聚焦能抵消扩散作用,使区带越走越窄由于这种电聚焦作用,不管样品加在什么部位,都可聚焦到其电点,很稀的样品也可进行分离可直接测出蛋白质的等电点,其精确度可达0.01pH单位.

载体两性电解质必需具备的条件:(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力,以便能控制pH梯度,而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程. (2)在等电点必需的足够高电导,以便使一定的电流通过,而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数,使整个体系中的电导均匀,如果有局部电导过小,就会产生极大的电位降,从而其他部分电压就会太小,以致不能保持梯度,也不能使应聚焦的成分进行电迁移,达到聚焦.(3)分子量要小,便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开. (4)化学组成应不同于被分离物质,不干扰测定.(5)应不与分离物质反应或使之变性.总起来说,当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时,它在等电点的解离度大,缓冲能力强,而且电导系数高,这就是好的载体两性电解质.

理想的载体两性电解质的合成:具有几个pH值很相近的多乙烯多胺(如五乙烯六胺)为原料,与不饱和酸(如丙烯酸)发生加合反应:加合反应优先加在α,β饱和酸的β碳原子上,调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基,这种合成方法与一般有机会合成不同,有机合成一般要求合成的产物越纯越好,而这里要求合成出的产物越复杂越好,要有多异构物和同系物,以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值,从而得到平滑的pH梯度.载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围,分子量在300-1000之间,它们的缓冲能力等于或优于组氨酸,电导性能良好,可以使电场强度分布较均匀,它们的水溶性良好,在1%水溶液中的紫外吸收值(260mμ)很低.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1. 1mol/LNa3PO3

2. 1mol/LNaOH

3. 1%甘氨酸

4.染色液:0.2%考马斯亮蓝

5.10%三氯乙酸

6.5%磺基水杨酸

7.电泳仪

8.脱色液:35%无水乙醇与10%冰乙酸等体积混和

9.20%甘油

二 器材

1.微量注射器

2.薄层胶片

3.滤纸

三 材料

透析后的蛋白质样品

【 操 作 】

1.薄层胶片的灌制

(1)配制凝胶溶液(2)架制胶室(3)灌胶(4)保存

2.样品的预处理:透析除盐,用1%甘氨酸或载体两性电解质为溶剂溶解透析后的蛋白质样品.

3.样品的施加: 将滤纸(擦净纸)剪成0.4×0.5cm2的小方块,先贴在胶质上,再用微量注射器滴加一定量的样品.

4.电极液的施加:电极液采用1mol/LNa3PO3为正极液,1mol/LNaOH为负极液.用滤纸条浸润电极液,然后分正负极,贴加在薄层胶片的两端.

5. 电泳的条件: 4℃下电泳或室温通冷凝水电泳.起始电压为60V,15分钟调至120V,转而恒流(每cm胶片长度0.8-1.0mA),约1小时左右,电压便上升到600～700V,再转而恒压600V或700V,维持3～3.5小时即可结束电泳.

6.pH梯度的测定: 把1×7 cm2薄层胶片切下来,分成14等分,每份加0.4ml重蒸水,搅碎后,测出pH.

7.染色及保存: 蛋白质染色步骤:5%磺基水杨酸与10%三氯乙酸等体积混合固定1小时置脱色液(35%无水乙醇与10%冰乙酸等体积混匀)45min0.2%考马斯亮蓝R250的脱色液溶液(W/V)染色30min置脱色液中,37℃温箱内过夜.染色后的胶片可放在20%甘油中,也可制成干片.

8.等电点的测定: 测定染色后所分离的区带距正极端的长度,按pH曲线找出其相应的等电点.

实验十八 牛乳中酪蛋白磷酸肽的制备

【 原 理 】

牛乳中含丰富的蛋白质,其中主要是酪蛋白.酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量的5/6.酪蛋白是一种含磷蛋白的不均一混合物.蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降低.将牛乳的pH调整至4.8,即酪蛋白的等电点时,酪蛋白即沉淀出来.用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪,得到纯的酪蛋白.牛乳酪蛋白中含有磷酸肽,其活性中心是磷酸化的丝氨酸和谷氨酸簇,是最有效的促钙吸收因子.酪蛋白经酶水解可产生酪蛋白磷酸肽.氮磷比是评价CPP产品质量的最重要指标,氮磷比(N/P)越小,则CPP产品中磷酸基密度越高和肽链越短,它促进人体对钙吸收的生理活性也越高,N/P一般应小于7.5.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.乙酸钠缓冲液(0.2mol/L pH4.6)

2.1%NaOH

3.10%乙酸

4.乙醇

5.乙醚

6.0.1mol/LnaOH

7.胰蛋白酶

8.pH7.4,0.1mol/LTris-HCl缓冲液

二 器材

1.pH计

2.离心机

3.表面皿

4.

三 材料

1.新鲜牛乳

2.酪蛋白

【 操 作 】

酪蛋白的制备

取新鲜牛乳300ml,放入250ml烧杯中加热至40℃.加入100ml加热至同样温度的乙酸钠缓冲液,一边加一边摇动,并用pH计检测,调整混合液的pH为4.8(用1%NaOH或10%乙酸进行调整).冷却至室温,继续放置5分钟,离心(2500r/min,20min)获沉淀物,用少量蒸馏水洗几次,过滤.将洗净的沉淀物悬浮在约 30ml乙醇中,离心得沉淀,用乙醇和乙醚等量混合液洗涤两次,最后用50ml乙醚洗一次.取出抽干的粉状物,摊开在表面皿上,使乙醚完全挥发.

配比方法：准备好1L容量瓶蒸馏水，固体的NaOH。根据公式算出1摩尔氢氧化钠的量。利用公式c等于n/v计算出氢氧化钠的物质的量n。再利用公式n等于m/M计算出氢氧化钠的用量m。将计算出的量倒入1L容量瓶中加入蒸馏水至刻度摇匀即可。

由于各种所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种不同的培养基，这些培养基可根据所含成分、物理状态、以及不同的使用目的等而分成若干类型。

1.按照培养基的成分来分

培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。

(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。

(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

2.按照培养基的物理状态分

培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。

(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。

(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。

(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。

3.按照微生物的种类分

培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。

常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。

4.按照培养基用途分

培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。

(1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。

(2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

(3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。

营养琼脂（普通琼脂）

成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤） 100毫升

琼脂（视天气，琼脂质量而定）

制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。

用途：作普通琼脂平皿。

血琼脂平板（BA）

制法：取营养琼脂（PH7．6），加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾注于平板或分装试管，制成斜面备用。

用途：1． 一般棉拭子均接种此培养基。

2．尿液，脓液

3．分离细菌标本用。

基础培养基 （肉膏汤BB）

成份：蛋白胨 10克 牛肉膏5克

氯化钠 5克水 1000毫升

制法：将以上各物称好，加水煮沸溶解，用1NNOH校正PH至7．6，过滤分瓶，121℃高压灭菌，20分钟备用。

用途：1 作耐药试验，增菌用分装小管。

2 作普通琼脂斜面。

血液培养基（大管肉汤培养基）

成份：1 新鲜牛肉浸液1000毫升

2 PABA（对氨基苯甲酸〔相当于10mg/毫升〕） 1g% 1毫升

3 MgSO4 [相当于0．493/100毫升] 49．3% 1毫升

4 枸椽酸钠 0．3g

制法：1 将1号，4号混合液，2号，3号液分装高压灭菌。

2 取灭菌1，4号混合液用无菌法加入PABA，MgSO4，再分管，行无菌试验三天方可使用。

用途：作血，骨髓培养用。

肠道杆菌培养基（伊红美兰琼脂）

成份： 蛋白胨 10克乳糖 10克

氯化钠 5克 琼脂 25（22）克

水 1000毫升2%伊红溶液20毫升

0．5%美兰溶液 20毫升

制法：将蛋白胨，氯化钠琼脂称好，加水1000毫升使溶解，校正PH7．4过滤，补足失水，加入2%伊红溶液20毫升，0．5%美兰溶液20毫升，（115℃高压20分钟），冷却至50℃左右倾注平板，凝固后存冰箱备用。（高压以后方可再加乳糖）

用途：用作分离沙门氏，志贺氏菌属，也作菌群调查。

罗文斯坦培养基

成份：磷酸二氢钾 2．4克 硫酸镁 0．24克

枸椽酸钠 0．6克 天门冬素 3．6克

纯甘油（丙三醇） 12毫升 水 600毫升

马铃薯粉 30克 鸡蛋1000毫升（约3公斤）

2%孔雀绿水溶液 20毫升

制法：1 除鸡蛋外（还有孔雀绿）。可将其它物品称好，放入大三角瓶包扎好，高压灭菌。

2 鸡蛋用75%酒精泡30分钟，灭菌法打蛋，倒入盛有玻璃珠的灭菌三角烧瓶内充分将鸡蛋摇散。

3 将各成份按比例配好，分装每管约5毫升。

4 间歇灭菌第一次90℃1小时，第二次80℃半小时，第三次80℃半小时（或放85℃烤箱内连续二次）。

质控标准： 1 灭菌试验合格。

2 接种结核杆菌要求两星期生长良好。

用途：作结核分枝杆菌培养用。

结核半固体培养基

成份：磷酸氢二钠 19克 硫酸镁 0．6克

磷酸二氢钾 2．5克 天门冬素5克

1%孔雀绿 1．5克 甘油 20毫升

吐温80（10%） 5毫升 水 1000毫升

枸椽酸钠2．5克 动物血清100毫升

琼脂1．5克（80小时用甲醇去脂）

1%孔雀绿 0．78毫升 吐温80（10%） 5毫升

加动物血清 100毫升

制法： 1 除血清外将上述药品均称好，放入煮沸溶解，调PH7。2

2 分管（每管约10毫升）包扎好，高压，121℃半小时灭菌。

3 待冷后无菌法加无菌血清（绵羊血或兔血）每管约1毫升备用。

2 临床微生物培养基手册

4 去除琼脂方法：取琼脂若干或于三角烧瓶中加甲醇于琼脂1毫升用塞密封，放37℃温浴80小时，每天摇动一次，冷却后到时取出用滤纸过滤，待琼脂自然冷却后备用。

质控标准：1无菌实验合格。

2琼脂硬度合适而清亮。

3接种标准结核杆菌用，强度合适即可用。

用途：培养结核杆菌用。

亚碲酸钾血琼脂平板

成份：琼脂基础 100毫升 10%葡萄糖 2毫升

1%亚碲酸钾 4．5毫升 绵羊血 10毫升

制法：1将琼脂基础溶解好，加入羊血。

2马上加热使成咖啡色后，稍冷再加入10%葡萄糖2毫升与1%亚碲酸4．5毫升混合后倒入无菌平板，

2

凝固后存冰箱备用。

质控标准：接种白喉杆菌生长良好，其它革兰氏阴性菌均抑制生长。

用途：供培养及鉴别白喉杆菌用。

米培养基

成份：白米 20克 水 1000毫升

琼脂 20克 吐温80 10毫升

制法：1将20克米加水200毫升煮沸45分钟，煮时将容器盖好。

2用纱布过滤，只要米汤，不要饭，加水至1000毫升。

3加琼脂20克，吐温-80 10毫升煮溶，分装中型管（每管约3毫升），包扎好，高压，121℃半小时，消毒备用。

质控标准：1灭菌。

2要求清亮。

3接种白色念珠菌17-24小时生长良好，并产生厚膜孢子。

用途：培养白色念珠菌用。

蛋白胨水培养基

成份：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克

水加至100毫升PH调至 7．8

制法：把以上各物称好溶于水，调节PH7．6分装消毒备用。

质控标准：1 放置37℃无菌生长。

2 接种大肠杆菌24小时生长良好。

3 可作中国兰平板基础液。

可作靛基质基础液（作此试验需要色氨酸蛋白胨）。

血培养基

成份：蛋白胨 10克 牛肉膏 5克

氯化钠 5克葡萄糖 3克

枸椽酸钠 3克MgSO4。7H2O 20毫升

0．5%PABA 10毫升 酵母浸液 10毫升 0．2克（2%过滤）

*酚红0．4% 6毫升 水 1000毫升

琼脂 0．5克

*：作大BB，小BB时，不要加酚红和琼脂。

制法：1。除PABA、硫酸镁、酚红外均称好煮化调PH7．4

2。调好PH后再加酚红。

3。硫酸镁、PABA另外无菌再加入（亚细，小BB）

沙氏培养基

成份：蛋白胨 1克 水 100毫升

琼脂1．5克（琼脂粉1克%） 葡萄糖或麦芽糖 4克

3

制法：1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115℃20分钟。

2 趁热斜好，凝固备用。

质控标准：1无菌试验合格。

2接种霉菌比在其它培养基上生长良好，其它菌生长不好。

用途：作分离培养霉菌用。

注意：1 接种临床新鲜标本可先加1-2滴70%酒精让干后再接种于含12．5%氯霉素沙氏斜面培养基上。

2 也可用蜂蜜8克代替葡萄糖或麦芽糖。

肉渣培养基

成份： 牛肉渣 牛肉浸液（牛肉膏）

制法：将做牛肉浸液的牛肉渣，装入试管，高约3毫米，加入牛肉浸液或牛肉膏汤（PH7．6）约5毫升，比肉渣高一倍，液面上加入已溶解的凡士林，高约0．5厘米（不加也可），121℃高压灭菌20-30分钟后保存于冰箱内备用 。

用途：用于厌氧菌培养。

注意：如无肉渣也可用牛、羊血等代替，将血块先放入水内煮沸，取出成小块，血块在加热后摇匀成碎颗粒状。

单糖发酵管培养基（半固体）

3 临床微生物培养基手册

成份： PH7．6-7．8蛋白胨水 1000毫升（0．3克/100毫升）

1．2%酚红液 0．4毫升

琼脂 0．4 - 0．5克

10%糖或醇10毫升

制备：把蛋白胨水，琼脂加热溶解，然后加1．2%酚红液0．4毫升，10%糖10毫升，混匀，分装试管，每管约2-3毫升，经115℃高压灭菌20分钟后，分置于试管架上，贴上各类糖或醇类标签备用。

质控标准：细菌发酵糖类或醇而产生酸，能使培养基PH改变，指示剂由红变黄色，如因发酵产生气体则

半固体内产生气泡，如有动力则半固体由清亮变混浊。

明胶培养基

成份：肉浸液1000毫升（牛肉浸膏5克）

明胶 12克

制法：

100毫升肉浸液中，加入明胶12克，隔水加热煮化，校正PH7．2，分装小号试管，用阿诺氏间歇灭菌80℃30分钟，连续3日，或者108℃高压20分钟，冷却，贮存备用。

碱性蛋白胨水

成份：

蛋白胨 20克 氯化钠 5克

硝酸钾 0．1克 结晶碳酸钠（NaclCO3．12H2O） 0．2克

水 1000毫升

4

制法：将蛋白胨，Nacl，硝酸钾，结晶碳酸钠称好，溶于1000DW中，校正PH8．4分装试管，121℃高压

灭菌15分钟后备用 。

用途：用于霍乱弧菌培养。

葡萄糖蛋白胨水（M。V用）

成份：蛋白胨5克 葡萄糖 5克

K2HPO4 5克 水 1000毫升

制法：将上述称好溶解分装试管，调PH7．4高压灭菌115℃ 灭菌20分钟 ，或者葡萄糖加热煮沸后再倒试管

标准：灭菌试验合格。

接种大肠杆菌VP阴性，M阳性；接种产气杆菌VP阳性，M阴性。

用途：作鉴别肠道杆菌用。

枸椽酸盐培养基

成份：磷酸二氢铵0．1克 硫酸镁 0．02克

磷酸氢二钾0．1克 枸椽酸钠0．23--0．5克（0．36）

氯化钠0．5克 琼脂1．5克

0．5%溴麝香草酚兰2毫升 （调PH6．8再加）

制法：将上述称好，放入水中煮沸溶解，调PH6．8，然后分装中号试管，高压灭菌，趁热倒呈斜面，凝固

后备用。

标准：1灭菌试验合格，培养基呈果绿色适宜。

2接种大肠杆菌，培养基上不生长，也不变色。

3接种产气杆菌，培养基呈深兰色。

用途：作鉴别大肠杆菌用。

双糖铁培养基

成份：

下层：蛋白胨1克氯化钠 0．5克

葡萄糖0．2克 琼脂 0．3-0．5克

水 100毫升

将上述物质混匀调PH7．6后加1．2%酚红0．4毫升

上层：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克

乳糖 1克 硫代硫酸钠 0．03克

硫酸亚铁 0．02克 琼脂 1克

水 100毫升

制法： 1将下层配好，分装中号试管（1毫升），塞好包扎，15磅高压灭菌半小时，使凝固后备用。

2制上层时，先将蛋白胨水制好，加入硫酸亚铁，硫代硫酸钠，加热溶解PH8．1，再加入酚红分瓶，（每瓶300毫升，称取琼脂包扎灭菌，趁热加入乳糖隔水煮沸30分钟或112℃消毒15分钟）。

3取已制的下层管，每管用无菌法倒入上层液约1。5毫升，边斜放置使成斜面，凝固后备用。

标准：无菌试验合格，接种大肠杆菌下层产酸产气，上层产酸。

尿素培养基

成份：蛋白胨 0．1克 氯化钠 0．5克

磷酸二氢钾 0．2克 尿素0．2克（或10%2毫升）

葡萄糖 0．01克（或10%葡萄糖0．1毫升）

H2O 100毫升 酚红（0．2%）0．4毫升

4 临床微生物培养基手册

制法：1除葡萄糖，尿素外把其它药品称好放入水中煮沸，使溶解，调PH7．2过滤，15磅高压灭菌15分钟．

2配制尿素（灭菌）液：每100毫升基液内加2毫升．

3配制10%葡萄糖（灭菌）每100毫升加0．1毫升．

4分装小试管待用．

标准：

1灭菌试验合格．

2接种变形杆菌24小时呈红色．

用途：鉴定变形杆菌用．

胆盐中性红琼脂

成份：蛋白胨琼脂PH7．2-7．4 5000毫升

胆 盐2．5克

乳糖 5．0克

对氨基苯甲酸 25毫克

1%中性红溶液 25毫升

制法：

将胆盐，对氨基苯甲酸，乳糖趁热加入已灭菌之蛋白胨琼脂中，待冷至50-60℃时，加入1%中性红液2．5毫升，混合后即倾注平皿，凝固待用．

*：1%中性红：1克中性红加酒精60毫升，加水40毫升

丙二酸盐培养基（缩苹果酸钠）

成份：丙二酸钠 0．3克酵母浸膏0．1克

Nacl 0．2克硫酸铵 0．2克

K2HPO4 0．06克 KH2PO4 0．04克

水100毫升

PH6．8，高压灭菌备用．

0．2%溴麝香酚兰乙醇 1．25毫升

制法：与枸椽酸盐利用试验相类似，是测定细菌能否利用丙二酸盐与碳源．无机铵盐为氨源而生长，生长者使培养基变成碱呈兰色．

鉴定： 克氏杆菌 （+）赫夫尼亚 （+）

沙门氏菌 （—） 痢疾杆菌 （—）

苯丙氨酸培养基

成份：酵母浸液 1．5克 DL--苯丙氨酸 1克

磷酸氢二钠（无水）0．5克（或L-苯丙氨酸 0．5克）

氯化钠 2．5克 琼脂 6克

水 500毫升 PH7．4

制法：1 将上述成份加热溶解，分装于12*125mm口径的试管中，每管约4毫升．

2 高压灭菌15磅10分钟，趁热使试管斜置凝固后备用．

3 接种时划斜面．

用途：鉴定沙门氏菌用．苯丙氨酸脱氨酶试验沙门氏菌阴性．

双抗培养基

成份：

蛋白胨 10克牛肉膏 5克

氯化钠 5克 无水亚硫酸钠 3克

柠檬酸钠 10克 蔗糖 10克

琼脂粉 20克 水 1000毫升

制法：

1将上物称好，加热溶于水中．

2调PH8．2—8．4

3 分装高压灭菌后备用．

倾注平板前先加热溶解琼脂等冷至50℃左右，按无菌操作加入多、庆抗菌素充分摇匀， 倾注平板，凝固后备用．

（庆大霉素：150u/毫升，多粘菌素：1500u/毫升, 2毫升加至1000毫升培养基内，此相当于庆大霉素0.3u/毫升, 多粘菌素3u/毫升）

O2培养基

保存液：（文—腊氏液）

A液：硼酸12．405克 KCL14．912克

水 1000毫升

取A液250毫升 0．8%NAOH133．5毫升

NACL 20克 水 1000毫升

分装高压灭菌．

硝酸盐胨水

成份：

蛋白胨 1克

硝酸钾（无NO2）0．1克

H2O100毫升

PH7．4，高压灭菌分装备用．

（如无硝酸钾也可用硝酸钠0．02克，NACL0．05克，H2O100毫升）

用途：硝酸盐还原试验用．

原理：测定细菌能否还原硝酸盐为亚硝酸盐，后者在酸性条件下与a—萘胺和对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成红色的1-萘-4偶氮苯对磺酸．

制法：试剂甲液A对氨基苯磺酸0．8克溶于5N的醋酸100毫升．

B：乙液a-萘酚0．5克溶于5N的醋酸100毫升中

将细菌接种于硝酸盐水中37℃培养24--96小时，加入甲液0．1毫升，再加入乙液数滴，立即呈现红或紫色为阳性

5 临床微生物培养基手册

king氏培养基（能促进绿脓菌绿色素产生）

成分：

蛋白胨 2克 K2SO41克

甘油 1克 MGCL2 0.14克

琼脂 1.5克 H2O 100毫升

KING氏培养基（能促进绿脓菌荧光色产生）

成分：

蛋白胨 2克 甘油 1克

K2SO4 0.15克 MGSO4 4.7克 H2O 0.15克

琼脂 1.5克 H2O 100毫升

调PH7.2 15磅20分钟消毒后使成斜面备用．

七叶苷水解试验

原理：

粪链球菌能分解七叶苷（Escalin）其代谢产物与铁离子结合产生黑色沉淀，使培养基变黑．

方法：

将菌种接种在七叶苷或琼脂上37℃18小时，观察结果，培养基变黑色，其他链球菌能生长但不变黑色，肺炎链球菌不长．

成分：

七叶苷 0.1克 胰胨 1.5克

枸橼酸铁 0.2克 琼脂 2.0克（0.5克/50毫升）

胆汁 2.5毫升 H2O100毫升

PH7.0分装小试管内高压灭菌后备用（10磅20分钟）

七叶苷又名桑树皮甙，七叶灵，Aesclin Escnlim Bicolorin等．为白色针状结晶．水溶液兰色荧光．）

葡萄糖氧化发酵培养基（O/F）

成份：

蛋白胨2．7克 氯化钠 5．0克

0．2%溴麝香酚兰 0．03克琼脂 3克

KH2PO4 0．3克 葡萄糖10．0克

水 1000毫升

制法：以上成份除糖外，溶解调PH7．0，10磅高压灭菌20分钟后备用．

方法：挑取少量培养物接种两管，其中一管接种后加液体石腊不少于1厘米厚，两管同时35℃，培养过夜，

观察颜色的变化，若无颜色变化，需继续观察七天，每日观察刺层型别．

用途：适用于微球菌科和非发酵菌的鉴定．

麦康凯培养基

成份：

蛋白胨 20克 氯化钠 5克

乳糖 10克 琼脂20克

H2O1000毫升 1%中性红溶液3--4毫升

1%结晶紫0．1毫升 PH7．4

除中性红临时用时加入外，其余均高压灭菌备用．

邻硝基酚半乳糖甙（ONPG）酶试验

缓冲液：

Na2H2PO4 6．9克溶于40DW中，用5NNOH调PH7．0，再加水到50毫升，冰箱保存．用前若有结晶可稍加温，溶解后再用．

ONPG液：

称取ONPG（邻硝基酚--B--D半乳糖苷）80毫克，溶于15毫升D.W中，再加上缓冲液5毫升，放入冰箱中保存．此液不稳定，如出现黄色即不能用．

鉴别：

脑膜炎球菌和乳糖球菌及沙门氏菌属与枸橼酸菌属及亚利桑那氏菌属．

脑膜炎球菌和沙门氏菌属为阳性．

乳球菌，枸橼酸菌属和亚利桑那菌属为阳性．

半固体培养基

成份：

牛肉膏 3克 蛋白胨 10克

氯化钠 5克 琼脂2．5--4克

水 1000毫升

校正PH7．4，15磅高压15分钟．倾注平板，厚度约4mm，冷藏备用．

氨基酸脱羟试验培养基

成份：

L-氨基酸 0．5克 蛋白胨 0．5克

牛肉膏0．5克 葡萄糖 0．05克

吡多醛0．5克 水 100毫升

2%溴甲酚紫乙醇液0．5毫升2%甲酚红 0．25毫升

制法：除指示剂及氨基酸外，溶解，PH6．0，然后加入氨基酸（必要时重新调PH）及指示剂，混匀分装1毫升/管加10毫米厚石蜡油，高压10--15磅10--15分钟灭菌备用．

6 临床微生物培养基手册

注意：

1 使用DL型AA时量加倍．

2 最好同时接种空白管（即不含有AA的同样培养基）作对照．

3 培养基超过24小时可出现假阳性．

葡萄糖酸盐培养基

成份：

蛋白胨 1．5克酵母浸液 1克

K2HPO41克 葡萄糖酸钾40克

DW 1000毫升

溶解过滤分装，高压10磅15分钟．

结果：加班氏试剂，加热观察结果．

黄-橙色为阳性． 无颜色变化为阴性．

这些是我在网上摘的别人的 下面给了连接

分子式：HOOCCOCOOH

CAS号：

性质：以其水合物HOOCC(OH)2COOH形式存在，熔点121℃。溶于水、乙醇及乙醚。用钠汞齐还原，得羟基丙二酸。高温加热易脱去二氧化碳，生成乙醛酸(HOOCCHO)。蒸发其水溶液或有碱存在下于150℃加热失去一氧化碳，得草酸。将丙二酸二乙酯与亚硝烟(nitrous fumes)反应制取。其衍生物二乙酯CO(COOEt)2，熔点105～107℃(2.53kPa)，黄色液体。用作有机合成试剂。

软脂酸（palmitic acid），学名“十六烷酸”，又叫棕榈酸，是一种饱和高级脂肪酸，白色带珠光的磷片。 不溶于水，微溶于石油醚，溶於乙醇。易溶於乙醚，氯仿和醋酸。广泛存在于自然界中，几乎所有的油脂中都含有数量不等的软脂酸组分。用作沉淀剂、化学试剂及防水剂。

基本介绍中文名 ：软脂酸 英文名 ：Palmitic acid 别称 ：十六酸十六烷酸鲸乙酸棕榈酸鲸蜡酸 化学式 ：C16H32O2 分子量 ：256.42 CAS登录号 ：57-10-3 EINECS登录号 ：200-312-9 熔点 ：63ºC 沸点 ：351.5ºC 水溶性 ：不溶于水 密度 ：0.8527g/mL(25/4℃) 外观 ：白色带珠光的鳞片 闪点 ：>110 套用 ：用作沉淀剂、化学试剂及防水剂； 安全性描述 ：对呼吸道、眼和皮肤有 *** 性。大量口服引起胃部不适。  危险性描述 ：本品可燃，具 *** 性。 简介,编号系统,物性数据,分子结构数据,毒理学数据,生态学数据,套用,制备, 简介 中文同义词：鲸乙酸软脂酸十六烷酸棕榈酸C16:0软脂酸棕榈酸C16:0/软脂酸/十六酸棕榈酸鲸蜡酸 分子结构图 英文名称：Palmitic acid 英文同义词：1-Pentadecanecarboxylic acid1-pentadecanecarboxylicacidacidehexadecyliqueacidepalmitiqueCetylsαureEmersol 140Emersol 143emersol140 分子式：C 16 H 32 O 2 分子量：256.42 Mol档案：57-10-3.mol 编号系统 CAS号：57-10-3 MDL号：MFCD00002747 EINECS号：200-312-9 RTECS号：RT4550000 BRN号：607489 PubChem号： 物性数据 1. 性状：白色带珠光的鳞片。 2. 密度（g/mL,25/4℃）：0.8527 3. 相对密度（25℃，4℃）：0.841480 4. 熔点（ºC）：63 5. 沸点（ºC,常压）：351，271.5（13.3kpa） 6. 沸点（ºC, 13.3kPa）：267 7. 折射率(n60D)：1.43345 8. 常温折射率（n20）：1.430970 9. 常温折射率（n25）：1.427280 10. 气相标准燃烧热(焓)(kJ·mol-1)：-10132.4 11. 气相标准声称热(焓)( kJ·mol-1) ：-737.2 12. 液相标准燃烧热(焓)(kJ·mol-1)：-10031.1 13. 液相标准声称热(焓)( kJ·mol-1)：-838.5 14. 晶相相标准燃烧热(焓)(kJ·mol-1)：-9977.96 15. 晶相标准声称热(焓)( kJ·mol-1)：-891.48 16. 晶相标准熵(J·mol-1·K-1) ：452.37 17. 晶相标准生成自由能( kJ·mol-1)：-315.10 18. 爆炸下限（%,V/V）：未确定 19. 溶解性：不溶于水,微溶于冷醇及石油醚，加热时较易溶解，溶於乙醇，易溶於乙醚、氯仿和醋酸，在100ml水中只溶解0.00072g。 20 闪点（ºC）：>110 软脂酸广泛存在于自然界中，几乎所有的油脂中都含有数量不等的软脂酸组分。中国产的乌桕种子的乌桕油中，软脂酸的含量可高达60%以上，棕榈油中含量大约为40%，菜油中的含量则不足2%。 分子结构数据 1、 摩尔折射率：77.73 2、 摩尔体积（m3/mol）：287.3 3、 等张比容（90.2K）：690.5 4、 表面张力（dyne/cm）：33.3 5、 极化率（10-24cm3）：30.81 毒理学数据 1、皮肤或眼睛 *** 性：人，皮肤接触，标准 Draize test试验，75mg/3D，轻度反应。 2、急性毒性：大鼠经口LD50：>10mg/kg；小鼠静脉LC50：57mg/kg。 3、致癌性：小鼠移植TCLo：1000mg/kg。 生态学数据 通常来说对水是不危害的。 若无 *** 许可，勿将材料排入周围环境。 套用 用作沉淀剂、化学试剂及防水剂；棕榈酸用于制造无味氯霉素及各种棕榈酸金属盐，可用作乳液聚合时的乳化剂。 软脂酸的钠盐或钾盐可作乳液聚合时的乳化剂，软脂酸的钠盐是肥皂的主要成分之一，其铝盐和锌盐等用于润滑剂、涂料、油墨和增塑剂中。工业上软脂酸由牛油、猪油、棕榈油等动植物油脂经皂化、中和制得。在第二次世界大战中，软脂酸的衍生物曾被用作制造为凝固汽油弹。软脂酸与硬脂酸按照45%比55%的比例混合可以得到结晶的硬脂酸产品，可以运用到化妆品行业中去。 制备 软脂酸是第一种从脂肪生成中产生的脂肪酸，亦可以由它产生更长的脂肪酸。软脂酸盐对乙酰辅酶A羧化酶有负面反应，而乙酰辅酶A羧化酶可以催化乙酰辅酶A 生成丙二酸单酰辅酶A 的羧化作用。丙二酸单酰辅酶A 作为长链脂肪酸合成的前体,在脂肪酸的合成中作为C2 单位的供体,并且在脂肪酸的氧化中作为线粒体穿梭系统的调节因子。因而可以阻止软脂酸盐的生成。 软脂酸合成其他物质 软脂酸的生成 1. 乙酰CoA的转移 乙酰CoA可由糖氧化分解或由脂肪酸、酮体和蛋白分解生成，生成乙酰CoA的反应均发生在线粒体中，而脂肪酸的合成部位是胞浆，因此乙酰CoA必须由线粒体转运至胞浆。但是乙酰CoA不能自由通过线粒体膜，需要通过一个称为柠檬酸—丙酮酸循环（citrate pyruvate cycle）来完成乙酰CoA由线粒体到胞浆的转移。 首先线上粒体内，乙酰CoA与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化，缩合生成柠檬酸，再由线粒体内膜上相应载体协助进入胞液，在胞液记忆体在的柠檬酸裂解酶（citrate lyase）可使柠檬酸裂解产生乙酰CoA及草酰乙酸。前者即可用于生成脂肪酸，后者可返回线粒体补充合成柠檬酸时的消耗。但草酰乙酸也不能自由通透线粒体内膜，故必须先经苹果酸脱氢酶催化，还原成苹果酸再经线粒体内膜上的载体转运入线粒体，经氧化后补充草酰乙酸。也可在苹果酸酶作用下，氧化脱羧生成丙酮酸，同时伴有NADPH的生成。丙酮酸可经内膜载体被转运入线粒体内，此时丙酮酸可再羧化转变为草酰乙酸。每经柠檬酸丙酮酸循环一次，可使一分子乙酸CoA由线粒体进入胞液，同时消耗两分子ATP，还为机体提供了NADPH以补充合成反应的需要。 2. 丙二酰CoA的生成 乙酰CoA由乙酰CoA羧化酶（acetyl CoA carboxylase）催化转变成丙二酰CoA(或称丙二酸单酰CoA)，乙酰CoA羧化酶存在于胞液中，其辅基为生物素，在反应过程中起到携带和转移羧基的作用。该反应机理类似于其他依赖生物素的羧化反应，如催化丙酮酸羧化成为草酰乙酸的反应等。反应如下： 由乙酰CoA羧化酶催化的反应为脂肪酸合成过程中的限速步骤。此酶为一别构酶，在变构效应剂的作用下，其无活性的单体与有活性的多聚体（由100个单体呈线状排列）之间可以互变。柠檬酸与异柠檬酸可促进单体聚合成多聚体，增强酶活性，而长链脂肪酸可加速解聚，从而抑制该酶活性。乙酰CoA羧化酶还可通过依赖于cAMP的磷酸化及去磷酸化修饰来调节酶活性。此酶经磷酸化后活性丧失，如胰高血糖素及肾上腺素等能促进这种磷酸化作用，从而抑制脂肪酸合成；而胰岛素则能促进酶的去磷酸化作用，故可增强乙酰CoA羧化酶活性，加速脂肪酸合成。 同时乙酰CoA羧化酶也是诱导酶，长期高糖低脂饮食能诱导此酶生成，促进脂肪酸合成；反之，高脂低糖饮食能抑制此酶合成，降低脂肪酸的生成。 3. 软脂酸的生成 在原核生物（如大肠杆菌中）催化脂肪酸生成的酶是一个由7种不同功能的酶与一种酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）聚合成的复合体。在真核生物催化此反应是一种含有双亚基的酶，每个亚基有7个不同催化功能的结构区和一个相当于ACP的结构区，因此这是一种具有多种功能的酶。不同的生物此酶的结构有差异。 软脂酸的合成实际上是一个重复循环的过程，由1分子乙酰CoA与7分子丙二酰CoA经转移、缩合、加氢、脱水和再加氢重复过程，每一次使碳链延长两个碳，共7次重复，最终生成含十六碳的软脂酸。 脂肪酸合成需消耗ATP和NADPH+H+,NADPH主要来源于葡萄糖分解的磷酸戊糖途径。此外，苹果酸氧化脱羧也可产生少量NADPH。 脂肪酸合成过程不是β-氧化的逆过程，它们反应的组织，细胞定位，转移载体，酰基载体，限速酶，激活剂，抑制剂，供氢体和受氢体以及反应底物与产物均不相同。 4、可以通过乌桕油，棕榈油，牛羊油，猪油进行水解，分离得到组分混合的脂肪酸，然后再分离提纯得到需要的软脂酸，由于乌桕树，猪牛羊油的国产及进口量有限，所有时下国内外很多的企业基本是通过用棕榈油水解分离提纯得到软脂酸，然后在往下游发展。