苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理,以及这三者的作用是什么

DNA提取的完整步骤 ：

1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。

3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0100mM EDTA, pH8.0)

4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml),

是其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。 5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液

中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。

6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心

10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。 7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心

5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。

8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀

10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

注意事项：

1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。在抽提DNA时，为了均匀混合，必须剧烈震荡，在酚氯仿中加入少量异戊醇，可以减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。（苯酚相对密度：1.07，氯仿相对密度：1.49）。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层（有机相）,DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。异丙醇或无水乙醇等会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合，沉淀DNA；回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，干燥后用蒸馏水或TE缓冲液（Tris和EDTA配置而成）溶解DNA备用。

Mullis最初使用的dag和美式大肠杆菌。DNA聚合酶l的Kenow片段，其缺点是：（1）Klenow酶不耐高温，90·C会变性失活，每次循环都要重新加。

（2）引物链延伸反应在37·C下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DN***段不均一。此种以Kenow酶催化的PCR技术水饺传统的鸡。基因扩增具备的突出的优点，但由于Klenow耐不耐热，在DNA模板进行热变形性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给技术操作程序添加了不少困难。这使得。PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DN***段很均一，真实性也较高，只有无所期望的一种DN***段。但每循环一次。仍需加入新酶，1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermus aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。此类具有以下特点，（1）耐高温，在70·C下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93·C下反应2h后残留活性是原来的60%。在95·C下反应2h后期残留活性是原来的40%。（2）在变热性时会被钝化，不必在每次扩充反应在后再加新酶。（3）大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩充长度（2.0kb）由于提高扩充的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶lklenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶（Taq DNA Polymerase）此酶的发现使PCR广泛被应用。