液相色谱问题请高手指点

液相色谱仪使用操作规程总流程：

超纯水冲洗柱——流动相分离样品——超纯水冲洗柱 ——纯乙睛保存柱

1． 电源准备

打开稳压器电源开关，须待电压指示至 220V 后，才能开启其他有关设备。

2． HP1100 高效液相色谱仪的准备

试剂：三氟乙酸

乙腈(Fisher 公司产品色谱纯)

超纯水(Millipore 超纯水)

冰乙酸

溶液配置：贮液瓶与流动相的准备

A 液 0.1%三氟乙酸 （三氟乙酸 1ml，超纯水 999ml）室温保存

B 液 60%乙腈 （乙腈 600ml， 超纯水 400ml）室温保存

样品液 0.01%乙酸 （冰乙酸0.01ml，超纯水 100ml）室温保存

泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是 1%色谱纯甲醇 室温保存

注：贮液瓶应用超纯水清洗干净，备用。

流动相溶剂用洁净硼砂漏斗精滤除去微小颗粒。

操作者必须清楚并注明 A、B 贮液瓶盛装为何种溶剂。

冲 洗 泵 头 ： 用 注 射 管 于 软 塑 料 管 末 端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 调 节 流 速 开 关 控 制 流 速 为20-30drop/min.。

① 流动相管道排气

如果管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动，用注射管于流动相出口的塑料管末端抽吸至管道内气泡排除完全。操作时，我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。）

② 开机

③ 进入 HP1100 操作系统

a.双击 WIN-95 操作界面中左下角 Instrument 1 online 图标，进入 HP1100 工作站软件操作界面。单击工作站操作界面上方 Run control 菜单，在下拉菜单中找到 Sample Info 子菜单，单击。在 Sample Info 信息框内定义操作者、样品前缀及编号、保存路径等参数。在保存路径项下，将可定义子目录分别输入操作者拼音缩写，以方便检索时互不干扰。

b.等待工作站操作界面中泵、柱温箱、检测器各指示图标由灰色转变为绿色后，单击泵、检测器各图标可从其各自弹出的菜单中设定流动相各溶剂比例、流速等。

（1）

液相色谱法简介

气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1～10mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。

高效液相色谱所用基本概念：

保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/?+C?。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可知，气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75～80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。

1.分离原理

凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图14—2中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图14—2中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。

2．固定相

凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大，可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水体系的常压凝胶色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力可用到70kg/㎝2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀度小，不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。

3．流动相

在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。

环已烷

:-0.2、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2

数值越大，极性越大

反向色谱，一般是先选择极性大的，比如乙腈，后选择极性小的，但可多时候要加三氟乙酸（乙酸、磷酸、柠檬酸）和三乙胺（醋酸铵）等调节PH值。

如有疑问，请追问。

常用的固定相：氰基、苯基、C8、C18等

常用的流动相：有机相为乙腈,甲醇,四氢呋喃,水相为超纯水.调节ph值一般酸有磷酸,三氟乙酸,乙酸,三乙胺,磷酸盐（钾盐和钠盐）,乙酸钠等.

1. HPLC高效液相色谱溶剂：

? 低紫外吸收

? 非挥发性物质、游离酸、游离碱水含量低

? 用于荧光检测

for HPLC

gradient grade, for HPLC

for LC-MS

for preparative chromatography Prepsolv ?

用途：用于液相色谱（LC）品制备、LC品析、LC-MS析

2. 农残级痕量析高纯溶剂：

? 极低农残背景值（≤5 pg/ml ）挥发性组极少

? GC控制（ECD-PND检测）质量靠稳定性高

? N、P、S等元素背景值低基线平稳经性能测试用于氯联苯（PCBs）、机氯农药、机磷农药残留痕量析及其适用于GC-ECDGC-NPD检测化合物GC、GC-MS析