化学试剂如硫酸铵（AP），那个AP是什么意思

化学试剂纯度

我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、

基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。

（1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试

剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。

（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合

于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。

（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于

工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。

（4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。 除了上述四个级别外，目前市场上尚有：

基准试剂（PT：Primary Reagent）：专门作为基准物用，可直接配制标准溶液

配胶AP是过硫酸铵。硫酸铵为催化剂，四甲基乙二胺为加速剂，在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

ap胶的材料

AP材料是指材料的安全性通过了毒物学专家的检测，证明产品成分中不包含足够量对人体造成伤害或有毒作用的原料，不会对人体造成急性或慢性的伤害，AP标签正在取代原有的无毒标签CP和HL，带有AP标签和性能认证证书的产品被认证为满足ACMI和其他标准机构制定的材料、工艺、质量和颜色的特殊标准。

有两种方法。

1.过硫酸胺：0.1g

2.蒸馏水：1ml。

现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周的时间。

过硫酸铵为白色结晶或粉末。无气味。干燥纯品能稳定数月，受潮时逐渐分解放出含臭氧的氧，加热则分解出氧气而成过硫酸铵过硫酸铵为焦硫酸铵。易溶于水，水溶液呈酸性，并在室温中逐渐分解，在较高温度时很快分解放出氧气，并生成硫酸氢铵。10%过硫酸铵的配制的配置属于溶质的质量分数问题。可用下式表示：溶质的质量分数=(溶质质量/溶液质量)×100%。注意：10％过硫酸胺溶液在4℃保存时间可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。

AP 与ARDS

印度昌迪加尔Surinder S. Rana IF not found

Shah, J., &Rana, S. S. (2020). Acute respiratory distress syndrome inacute pancreatitis. Indian J Gastroenterol, 39(2), 123-132.doi:10.1007/s12664-020-01016-z

这篇对于641的肠淋巴研究参考价值不大

各种毒素、炎症介质和胰酶导致的肠道通透性增加，通过肠-淋巴-肺轴加重肺损伤，导致细菌内毒素移位增加。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种威胁生命的呼吸衰竭形式，由于炎症性肺水肿引起缺氧[6]。根据PaO2:FiO2（表），ARDS的柏林定义是最被接受的定义，它定义了从临床损伤到出现新的呼吸症状、特定的胸部X线表现和ARDS的严重程度的具体时间范围。急性呼吸窘迫综合征不是主要疾病，但它是各种直接和间接呼吸损伤的最终结果。肺炎、吸入性损伤和吸入仍然是主要的直接原因，而败血症、严重烧伤和胰腺炎是急性呼吸窘迫综合征的主要间接原因。

柏林定义

根据柏林定义，ARDS是一种急性弥漫性肺部炎症，可导致肺血管通透性增加，肺重量增加，参与通气的肺组织减少。其临床特征为低氧血症，双肺透光度降低，肺内分流和生理无效腔增加，肺顺应性降低。ARDS急性期的病理学特征包括弥漫性肺泡损伤（如水肿、炎症、透明膜或出血）。

FiO2, Fraction of inspiration O2, 吸入气中的氧浓度分数

在AECC定义的基础上，柏林定义主要做了以下几方面的修订：

① 发病时间：有研究显示，对于有ARDS危险因素的患者，大多数患者可在72 h内符合诊断标准，几乎所有患者可在7 d内符合诊断标准。因此，将危险因素致ARDS的“发病时间”界定为1周内。

② 影像学诊断： 仍沿用既往标准，但柏林定义明确指出，可采用胸部计算机体层摄影（CT）代替胸部X线摄影。

③ 肺水肿的起因： 排除肺动脉楔压变量，只要主治医师根据患者现有资料判断，其存在不能完全由心力衰竭或液体超负荷解释的呼吸衰竭所致肺水肿，即可诊断ARDS。若无ARDS危险因素，则需要进行客观评估（如，进行超声心动图检查），以排除静水压升高的肺水肿。

④ 氧合： 由于临床医师易将ALT误理解为一组患有不严重低氧血症的患者，取消了“ALT”的术语。将PaO2/FiO2介于200～300 mm Hg、同时PEEP≥5 cm H2O者纳入ARDS标准，并归类为轻度ARDS。

⑤ 该定义规定呼吸末正压（PEEP）≥5 cm H2O，持续气道正压（CPAP）≥5 cm H2O。根据不同的氧合指数，将病情分为轻、中和重度。该病情分级与机械通气时间和死亡率相关，ARDS严重程度越高，死亡率越高，幸存者接受机械通气的时间越长。轻中重度ARDS对应的死亡率分别为27%、32%和45%，相应的机械通气时间分别为5 ，7 和9 d 。

⑥ 其他生理学测量指标：死腔增加在ARDS患者中常见，并与死亡率增加相关。由于测量死腔具有挑战性，本定义采用分钟通气量和动脉血二氧化碳分压（PaCO2）代替（VECORR=分钟通气量×PaCO2/40）。

改良马歇尔评分系统用于定义和判断急性胰腺炎器官衰竭的严重程度。根据改良马歇尔评分对呼吸衰竭的定义要求PaO2:FiO2比率小于300(评分≥2)；他们将严重性分数2、3和4分别定义为201–300、101–200和≤100之间的PaO2:FiO2比率。虽然改良的马歇尔评分已经定义了呼吸衰竭的标准，但是呼吸衰竭是否是由于一些可治疗的原因引起的，如胸腔积液、肺不张、肺水肿或急性呼吸窘迫综合征，还没有具体说明。同样，尽管根据该标准呼吸衰竭的严重程度与柏林对ARDS的定义相似，但其他柏林标准并未阐明。根据柏林定义，呼吸系统症状的发作和恶化应在7天内。然而，在因局部并发症导致迟发性器官衰竭的急性胰腺炎中，这一标准可能不成立。虽然急性呼吸窘迫综合征是急性胰腺炎最常见的呼吸衰竭原因之一，并与高死亡率相关，但柏林定义尚未在急性胰腺炎中得到特别验证。因此，急性呼吸窘迫综合征的理想定义需要在修改后的马歇尔评分和柏林定义中进行修改。它需要大规模的多中心前瞻性试验，以更好地定义和理解急性胰腺炎的急性呼吸窘迫综合征。

急性胰腺炎诱发急性呼吸窘迫综合征的发病机制尚不完全清楚。然而，尸检研究表明，急性胰腺炎诱发的急性呼吸窘迫综合征的发病机制与其他原因引起的急性呼吸窘迫综合征没有区别。

急性呼吸窘迫综合征的肺损伤分为三个阶段: 渗出期 ( ⅰ 期 ) ，伴有弥漫性肺泡损伤、微血管损伤 、 ⅰ 型肺细胞损伤、肺血管通透性增加和肺水肿 ； 增生期 (II 期 ) ，其中发生 II 型肺细胞增生和肺修复，这在损伤后约 7-14 天发生；和纤维化阶段 ( 第三阶段 ) ，其中急性炎性细胞消退和纤维化发展 。

胰腺损伤后，胰蛋白酶释放出来，直接对肺血管造成损伤，增加其通透性。更重要的是，胰蛋白酶引起其他介质的激活，如磷脂酶A2和各种补体因子，它们在急性呼吸窘迫综合征的发展中也起着重要作用。

肺表面活性物质 是 磷脂酶 A2 的主要底物之一。研究表明血清磷脂酶A2水平和肺损伤程度具有相关性。胰腺和胰腺外来源的磷脂酶A2血清水平与肺损伤评分相关。

血小板活化因子(PAF)是一种有效的生物介质，它刺激白细胞并促进它们迁移到组织空间。在实验性胰腺炎中，发现胰腺、腹水和肺中的PAF升高。来昔帕泛是一种强有力的PAF抑制剂，在没有生存获益的胰腺炎患者中也显示出一些有益的效果。

肿瘤坏死因子-α是急性胰腺炎早期炎症的重要介质。它导致炎症细胞的募集、激活和肺损伤的增加。此外，它与炎症的增加有关，有利于腺泡细胞坏死，而不是凋亡。

多种趋化因子如白细胞介素-8在急性胰腺炎时也升高。IL-8是中性粒细胞的强引诱剂，研究表明，与无ARDS的患者相比，AP和ARDS患者的支气管肺泡灌洗(BAL) IL-8水平更高。此外，白细胞介素-8和抗白细胞介素-8抗体复合物水平在急性胰腺炎患者中也与急性呼吸窘迫综合征的发展相关。

其他促炎细胞因子如白细胞介素-1β和白细胞介素-6也在急性胰腺炎患者中升高。这些细胞因子是巨噬细胞的重要激活剂，可增强B细胞和T细胞的激活，并增强炎症。

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)主要来源于T淋巴细胞，抑制巨噬细胞的随机迁移。它也是一种强有力的促炎细胞因子。在实验性重症胰腺炎中发现其在肺中的水平升高，并且发现抗MIF抗体显著提高动物模型的存活率。

与这些细胞因子相反，白细胞介素-10是一种抗炎细胞因子，它阻止巨噬细胞和T细胞产生促炎介质，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-1β。在急性胰腺炎中，研究表明白细胞介素-10水平较低，施用白细胞介素-10可降低实验动物模型中急性胰腺炎的严重程度。

各种粘附分子如E-或P-选择素、细胞内粘附分子(ICAM-1)和血小板内皮粘附分子-1 (PECAM-1)也被证明是上调的；这些增加了包括ARDS在内的各种器官衰竭的风险。

神经肽物质-P是一种炎症介质，被发现参与急性胰腺炎的发病机制。神经激肽受体-1 (NK1R)是P物质生物作用的受体。已发现阻断NK1R可降低胰腺炎及相关肺损伤的风险。

已发现急性胰腺炎患者的肠道通透性增加，各种毒素、炎症介质和胰酶已被证明可通过肠道-淋巴液-肺轴加强肺损伤。

研究表明，在急性胰腺炎患者中， 淋巴中细胞因子和胰酶的水平与急性呼吸窘迫综合征的发生比血浆水平 更密切相关。

此外，阻断腹部淋巴流动已被证明可以减轻急性胰腺炎诱导的大鼠肺损伤。

革兰氏阴性感染会导致各种内毒素的释放，由于肠道通透性增加，内毒素很容易转移，可能会加速急性呼吸窘迫综合征的发展。toll样受体4 (TLR 4)在被这些内毒素激活后启动炎症信号通路。 硫酸乙酰肝素 来源于细胞外基质，并在急性胰腺炎时升高。它是TLR-4的有效激活剂，可增强炎症并将局部炎症转化为全身炎症状态。

急性胰腺炎的呼吸衰竭也可能是由急性呼吸窘迫综合征以外的原因引起的。无放射学异常的低氧血症、基底肺不张、肺水肿、胸腔积液、胰胸膜瘘或肺栓塞是急性胰腺炎呼吸衰竭的重要原因。

目前已经开发了多种评分系统来预测这类危重患者的ARDS发展。 肺损伤预测评分 (pulmonary Injury Prediction Score, LIPS)是预测高危患者ARDS应用最广泛的评分之一。Gajic等评估了5584例危险患者，并对他们进行了前瞻性随访，以了解ARDS的发生率和危险因素。6.8%的高危患者在中位2天后发生ARDS。作者组成了LIPS评分，包括 易感疾病、酗酒、肥胖、低蛋白血症、需氧量、呼吸频率、糖尿病和酸中毒 。评分≥4分的阴性预测值很高，为97%，阳性预测值有限，为18%。评分≥4分的敏感性、特异性和曲线下面积(AUC)分别为69%、78%和0.8%。然而，在该研究中，只有5.8%的患者患有AP。没有提供AP的严重程度，在该研究中只有3%的AP患者发展为ARDS。因此，大规模AP患者的研究结果的通用性仍然值得怀疑。后续研究也证实了其敏感性、特异性和曲线下面积(AUC)相似[44,45]。然而，上述LIPS评分系统的阳性预测价值有限因此，后续的研究评估了急性生理学和慢性健康评估II (APACHE

II)评分系统、IL-6、IL-8、angiopoietin 2、sE-selectin等标志物在预测危重患者急性呼吸窘迫综合征中的作用。然而，这些研究多为单中心研究，样本量小因此，这些并没有成为治疗的标准。在这些标记中，当 血管生成素 2 被添加到LIPS中时，它显示出了有希望的结果。研究表明，将血管生成素2添加到LIPS中，阳性预测值(PPV)从18%、45%到60%增加，阴性预测值(NPV)、敏感性和特异性相似[46,47]。同样，Levitt等人前瞻性地招募了100例双侧胸片异常(并非由于左房高血压)患者，并跟踪观察他们是否发展为ARDS。初始需氧量>2 L/min、胸片上的空气浊度、免疫抑制剂的使用和SIRS的存在是ARDS发展[48]的预测因素。近年来，肺超声也通过估算 血管外肺容积 (EVLW) 在预测ARDS和危重患者治疗反应方面发挥了作用。

在他们的研究中，51名患者发生了ARDS，与没有ARDS的患者相比，ARDS患者的细胞因子水平更高。此外，持续性急性呼吸窘迫综合征患者第3天血清肿瘤坏死因子α、IL-6、IL-8和IL-1β水平均较基线升高，提示细胞因子在急性呼吸窘迫综合征发生发展中的重要作用，尤其是在急性胰腺炎早期。作者认为，IL-6≥80pg/mL或IL-8≥100pg/mL与SIRS同时出现对预测急性呼吸窘迫综合征发展的敏感性和特异性分别为73%和95%。

Skouras等人提出肺超声在预测急性胰腺炎患者ARDS方面有一定的应用价值。他们前瞻性地招募了41名AP患者，并在肺部超声上检查是否存在彗星尾部伪影。在他们的研究中，更多的ARDS患者出现了彗星尾部伪影。他们表明，肺非依赖区的超声检查和高CRP可以预测AP患者ARDS的发展。同样，Katageri等人同时评价连续肺超声在AP中的作用。研究表明，与中度或轻度ARDS患者相比，重度ARDS患者的B线数量更多。此外，B线评分超过48小时与干预需求增加或死亡风险增加相关。这两项研究显示了血管通透性增加和EVLW在ARDS发展中的作用，表现为彗星尾部伪影和B线的增加。

最近，人工神经网络(ANN)在预测AP患者ARDS中的作用也得到了探索。人工神经网络是一种高度复杂的分析技术，它可以比常规统计方法更有效地分析各种疾病相关危险因素之间的相互作用。Fei和他的同事最近探索了ANN在AP相关ARDS的预测和严重程度中的作用。随机选择152例重症急性胰腺炎患者建立人工神经网络模型，并对32例重症急性胰腺炎患者进行神经网络验证。选取13个变量，建立神经网络模型，准确率为84.43%。 胰腺坏死率、乳酸脱氢酶水平和氧合血红蛋白饱和度 是神经网络最重要的自变量。人工神经网络模型预测ARDS严重程度的准确率也较高(73.1%)。

近年来，miroRNAs(MiR)在预测急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的作用也得到了研究。最初，史等人。评估了miR-127在预测AP中ARDS的作用[56]。卢等人对24例重症急性胰腺炎患者血清标本中287种不同的miR进行了检测。他们发现12个循环miR在预测AP患者肺损伤中的作用。

许多药物已经在危重患者和AP患者身上进行了试验，以防止ARDS的发展；然而，目前还没有一种药物取得重大成功。正如在发病机制中所讨论的那样，已经探索了各种药物来预防或减轻AP中ARDS的严重程度。然而，所有这些研究都是关于预防急性胰腺炎急性呼吸窘迫综合征的动物和人体试验，这些研究都是有限的。最初，在II期研究中， 来昔帕泛 (PAF拮抗剂)被证明可以降低器官衰竭的发生率。然而，双盲安慰剂对照研究没有显示来昔帕泛在预防任何类型的器官衰竭方面的益处。在小鼠模型中，甲萘二酮(维生素K3)通过NF-Kβ途径下调P物质和H2S信号，在减轻胰腺炎和相关的急性呼吸窘迫综合征的严重程度方面显示出有益的作用。其他分子如表面活性蛋白D、脂氧素A4、甲磺酰甲烷、东莨菪素、白介素22和大黄素在各种动物研究中也被发现通过减少肺水肿、肿瘤坏死因子-α的产生、白介素-1β、白介素-6和基质金属蛋白酶-9的表达来减轻AP诱导的急性呼吸窘迫综合征。然而，在动物模型中这些令人鼓舞的结果尚未在临床研究中得到证实。

由于激活的血小板在内皮损伤和中性粒细胞趋化中的作用已被推测，阿司匹林也被尝试用于预防ARDS的发生。初步的回顾性研究表明，院前服用阿司匹林在ARDS的发生中起到了有益的作用。然而，最近关于阿司匹林对急诊科就诊的高危患者发生ARDS的多中心前瞻性双盲研究并未显示出对ARDS的发生或呼吸机空闲时间或死亡率的益处。皮质类固醇(抗炎)被认为是预防高危患者ARDS的有效药物。然而，多中心大型试验并未显示类固醇在预防ARDS方面有任何益处。同样，尽管最初的回顾性研究显示院前使用他汀类药物可能在预防ARDS中起作用，但随后的大型多中心试验并未显示他汀类药物在ARDS发生中的任何作用。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在ARDS的发病机制中起重要作用。血管紧张素转换酶(ACE)活性也被发现在慢性支气管炎患者的支气管肺泡灌洗液中升高。用ACE抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂（ARB）阻断RAAS在回顾性研究中显示出有益效果。然而，最近的研究没有发现住院前ACE抑制剂或ARB对高危患者发生ARDS的有益作用。N-乙酰半胱氨酸已经在预防ARDS的小型研究中得到评估，并取得了一些积极的结果。吸入类固醇，β2-激动剂和高渗盐水也被用于预防高危患者的ARDS，但效果不佳。

由于其他原因，AP中ARDS的管理协议与ARDS的管理协议相同。根据标准指南对AP进行管理至关重要。脓毒症和AP局部并发症的治疗应按制定的管理策略进行。ARDS的治疗取决于病情的严重程度。对于轻度急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者，可以提供其他保守治疗的氧气补充。如果患者病情恶化或出现更多缺氧，则应提供无创通气或机械通气。由于许多中、重度ARDS患者需要机械通气，有时可能会导致气压伤，因此了解和遵循各种肺保护策略是非常必要的。此外，一些治疗ARDS的一般原则，如液体限制策略和早期在机械通气患者中使用神经肌肉阻滞，都与改善肺功能、缩短机械通气时间和降低死亡率相关。肺保护性通气的主要目标是低潮气量策略(4~8mL/kg预计体重)，吸气平台压<30cmH2O。试验表明低潮气量策略对死亡率有好处。俯卧位在ARDS中也显示出更好的通气-灌注匹配，更均匀的潮气量分布减少了通气所致的肺损伤，以及更多的肺复张而更好的氧合。它已经显示出死亡率的好处，特别是在患有严重ARDS的患者中，如果每天至少进行12小时。同样，在需要通气支持的中度或重度ARDS患者中，高呼气末正压(PEEP)与更好的氧合和更低的死亡率相关。

ARDS患者由于间质和肺泡水肿导致的肺重量增加而发展成依赖性肺不张，这会限制可用肺容量，从而加重机械通气过程中的肺损伤。肺复张手法(RMS)可通过提高应用气道压力以打开塌陷的肺并增加参与潮气通气的肺泡单位数来减少肺不张。不同的RMS，如持续高持续气道正压(30-40 cm H2O)或PEEP的渐进性递增，已显示出有利于改善氧合和降低死亡率。 高频振荡通气 (HFVO) 是一种新的通气装置，它在较高的平均气道压下提供非常小的潮气量，导致塌陷的肺单位重新聚集，并改善氧合。然而，需要深度镇静以防止自发的吸气努力，并熟练使用这种方法限制了它的常规使用。同样，静脉-静脉体外膜氧合也曾在ARDS中尝试过，这种方法从大的中心静脉抽出血液，通过气体交换装置将其泵入，导致血液氧合并清除多余的二氧化碳，但没有太多有希望的结果。除上述通气策略外，还尝试了多种药物治疗急性呼吸窘迫综合征，β-2激动剂通过激活I型和II型肺泡细胞上的β-2受体增加钠转运，减轻肺水肿。然而，使用静脉或吸入沙丁胺醇的试验并没有产生令人满意的结果。糖皮质激素具有很强的抗炎和抗纤维化作用，已被尝试用于ARDS的治疗。在急性呼吸窘迫综合征病程早期(14天内)使用小剂量类固醇(甲基强的松龙≤2 mg/kg或等量)可减少通气时间、住ICU时间和死亡率。然而，由于并发症(特别是神经肌病和感染)的风险增加以及数据不足，目前不推荐其普遍使用。吸入一氧化氮也没有发现可以降低任何严重程度的ARDS的死亡率。他汀类药物也在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中进行了试验。然而，大型多中心试验的结果并未显示在无通气天数或死亡率方面有任何益处。角质形成细胞生长因子(KGF)被发现可以促进肺泡上皮修复；然而，使用KGF的研究结果显示，28天的死亡率较高。因此，目前还没有令人信服的药物治疗可以降低ARDS患者的严重程度或机械通气天数或死亡率。

细胞因子等炎症介质在急性胰腺炎急性呼吸窘迫综合征发病机制中的重要作用

 

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Western-Blot操作流程

试剂配制

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g

异丙醇 100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g

蒸馏水至 500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O（MW 358.14） 71.6g

蒸馏水至 1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g

超纯水至 100ml

溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20 Tween20 20ml

蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml

NaCl 0.438g

TritonX-100 0.5ml

蒸馏水至 50ml

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）

0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml

0.2 mol/L NaHPO4 81ml

NaCl 17g

蒸馏水至 2000ml

（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）

G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg

95％乙醇 50ml

磷酸 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水 4.85ml 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml

10％SDS 100 μl 50 μl

10%AP（过硫酸胺） 50 μl 25 μl

TEMED 5 μl 5 μl

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）

还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g

甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。

（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）

（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

10X丽春红染液 丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

蒸馏水至 100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

TBST缓冲液 20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g

TBST 100ml

最好现用现配。

洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 μl（通风厨里加）

SDS 2g

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml

超纯水至 100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

（可用可不用）

显影液（5X） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g

碳酸钠（无水） 33.75g

溴化钾 20.95g

补水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g

亚硫酸钠（无水） 15g

冰乙酸 12.6ml

硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多

买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。

化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。

操作步骤

（一） 蛋白样品制备

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、 按1ml裂解液加10 μ PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、 每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、 加400 μ单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、 用枪洗干上清后，加100 μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（二） 蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

3、 按下表在各管中加入各种试剂。

0μg

2.5μg

5.0μg

10.0μ

20.0μg

40.0μ

1mg/ml BSA

－

2.5μl

5.0μl

10.0μ

20.0μl

40.0μ

0.15mol/L NaCl

100μl

97.5μ

95.0μ

90.0μ

80.0μl

60.0μ

G250考马斯亮蓝溶液

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。

（2） 检测样品蛋白含量

1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μ待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩

减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒，当然操作不能太粗暴了）

6、 测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μ样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μ也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失、2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量）

7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

（3） 电泳：电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80-100V跑，到分离胶以后用150-200跑，结果也不错，总时间2h左右）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas的0441和0671比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。

（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上

另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）

（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）

（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（一般不需要做这步）

（五） 免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体）

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六） 化学发光，显影，定影

（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的，显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进

行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）

聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis 、A p、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。

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