如何用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA

我做乙醇沉淀的时候按以下步骤：1）酶切、去磷酸产物用dd水稀释至100ul，2）加入100ul酚氯仿，1，3000rpm离心5min3) 将上清取出，置于另一个0.5ml的EP管中，加入10ul 3M NaAc,200ul 无水乙醇，－20度放置1hr4) 1,3000rpm离心10min5) 倒掉上清，用pippet吸掉残余的乙醇，加入100ul75％乙醇，震荡，1，3000rpm离心5min6) 倒掉上清，用pippet吸掉残余的乙醇,空气中放置15min，待乙醇挥发干净，加入20－30ul ddH2O 溶解DNA.请问，在不降低纯化的质量和回收率的情况下，以上步骤那些地方可以节省时间？小于多少bp的DNA不能用乙醇沉淀法？我在第4、5步离心完毕，从来没有看到过管子底部有白色的DNA,不管是PCR产物还是质粒，但跑电泳是可以看到的，但不亮。请问，裸眼可以看到的DNA，量至少要多少ug?双酶切质粒的多克隆位点时，要切下一小段DNA（5－50bp）,这段DNA在乙醇沉淀时是不是也要沉淀下来？因为后续的操作可能是连接，它的存在对连接的效率是又影响的

1. 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L ，PH=5.2）充分混匀

2. 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，混匀，- 20℃ 15~30 分钟；

3. 12,000 g X 10 min，弃上清；

4. 再加1ml 70％乙醇，12000g X 1 分钟，弃上清；

5. 挥发至干；

6. 加 ddH2O 或TE溶解 DNA 沉淀。

可以，但是最好使用醋酸铵，也可以不加，回收效率可能会低一点，操作步骤：

方法一：

将忆确定的回收产物溶液于加有300 µL TE缓冲液的灭菌的1.5 mL Eppendorf管中。

加入等体积酚-氯仿-异戊醇，摇晃均匀。

12000 rpm离心5 min。

小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中，加入2.5~3倍体积（780 µL即可）预冷无水乙醇，以及10%水相体积的3 M NaAC（pH 5.2）。

置液氮3 min，取出后可置于－20℃放几min。小心防止管子爆裂。

12000 rpm离心10 min。

迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇清洗后置于恒温器上干燥（55℃）5~10 min至无乙醇气味，再加入20 µL ddH2O溶解。

取20 µL电泳定量后－20℃储存备用。

方法二：

先把乙醇-20度预冷，酶切完后加入2倍体积的无水乙醇，-20度放置10min以上，12000rpm离心10min，管底出现白色沉淀，倒掉上清，换用70%乙醇重复一次，再用水溶解白色沉淀既可，损失率蛮大，回收率只有40%，或者更低。

DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混 合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代懈水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增 大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15-30分钟即可。

乙醇：乙醇是一种有机物，俗称酒精，化学式为CH3CH2OH(C2H6O或C2H5OH)或EtOH，是带有一个羟基的饱和一元醇，在常温、常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体，它的水溶液具有酒香的气味，并略带刺激。有酒的气味和刺激的辛辣滋味，微甘。

乙醇液体密度是0.789g/cm(20C°) ，乙醇气体密度为1.59kg/m，沸点是78.3℃，熔点是-114.1℃，易燃，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，能与水以任意比互溶。能与氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多数有机溶剂混溶，相对密度(d15.56)0.816。

乙醇的用途很广，可用乙醇制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。医疗上也常用体积分数为70%-75%的乙醇作消毒剂等，在国防工业、医疗卫生、有机合成、食品工业、工农业生产中都有广泛的用途。

DNA：脱氧核糖核酸(英语:Deoxyribonucleic acid，缩写为DNA)又称去氧核糖核酸，是一种分子，双链结构，由脱氧核糖核苷酸(成分为:脱氧核糖及四种含氮碱基)组成。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。

主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为"蓝图"或"食谱"。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。

带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。

组成简单生命最少要265到350个基因 。

1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。