乙酰丁香酮（Acetosyringone）

乙酰丁香酮的配制方法：

1、用于拟南芥花侵染的，配制使用的溶剂为DMSO，母液为100mM，使用浓度请参照相关文献。

2、另外一种是用于愈伤组织的侵染，是用少量甲醇溶解后，再用蒸馏水定容。之后过滤除菌 。显然两者溶剂不一样，不过建议还是使用DMSO。

乙酰丁香酮（AS）的作用原理，是其可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合。所以最好让其有一定的诱导时间再转化，效果要好些，而不是加完后直接转化（需要活化）。

扩展资料

要使化学反应能发生，首先反应物分子必须发生碰撞，并在碰撞中使反应物分子中的化学键断裂，同时形成新的化学键。因此两个相碰撞的分子必须具有足够大的能量，否则就不能使旧键断裂，新键形成，因而就不能发生化学反应。

例如对于反应：2HI―H2+I2，两个HI分子发生反应，总是首先发生碰撞，碰撞中两个HI分子中的H原子互相趋近，生成H2，这就要克服来自两方面的阻力：

①H一I键断裂需克服其键能阻力；

②两个H原子相互靠近结合具有一定的斥力，也需依靠一定的能量去克服。只有使两个HI分子碰撞时的能量大于以上需克服的阻力，反应才能发生。阿仑尼乌斯在对其经验公式的理论解释中，提出了活化能的概念，他指出：

为了能发生化学反应，普通分子(具有平均能量的分子)必须吸收足够能量先变成活化分子，在此变化过程中所要吸收的最小能量称为活化能Ea。化能的单位是J/mol 。在一定温度下，活化能越大，反应就越慢。如图所示，对于一定的反应，活化能一定，若温度越高，反应就越快。

能引起化学反应的碰撞称为有效碰撞，发生有效碰撞时形成的中间活化物分子称为活化分子，活化分子的平均能量E’与反应物分子的平均能量E之差称为化学反应的活化能Ea。

参考资料来源：百度百科-活化

参考资料来源：百度百科-乙酰丁香酮

⑴ 转化受体可以是多种类型

ATMT转化的受体材料可以是多种类型的, 既可以用原生质体, 也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体。

⑵ 转化效率高

同传统的真菌转化方法, 如PEG-CaCl2法相比, ATMT方法的转化效率有明显提高。

⑶ 单拷贝的随机插入

ATMT的非同源转化, 大部分转化子为单拷贝的T-DNA插入。

⑷ 转化子稳定

M.purpureus的ATMA转化子经过四轮孢子培养及筛选过程后, 98%的克隆仍然表现出对潮霉素的抗性。

⑴ 双元载体的构建及工程菌株的制备

将具有合适真菌启动子的筛选标记基因插入到T-DNA的左边界和右边界之间, 然后把构建好的双元载体 (binary vector) 通过冻融法等方法导入A.tumefaciens中。

⑵ 工程菌株的培养与处理

接种含双元载体的根癌农杆菌工程菌株到含有合适抗生素的MM (minimal medium) 培养液 (Casas-Flores et al., 2004) 中, 28℃, 200r/min培养1-2d。

⑶ 共培养及转化子的筛选、鉴定

将上述 A.tumefaciens 菌液与等体积的真菌分生孢子悬浮液混合, 把混合液涂布在铺有玻璃纸固体IM培养基上, 在适宜的温度 (通常为28℃) 下共培养2-3d后, 将玻璃纸转移至适于真菌生长的固体培养基上, 于适宜温度下 培养数天 (4-5d) , 直至出现抗性菌落。

⑴ 根癌农杆菌（EHA105）的转化OD值

根癌农杆菌介导的高效转化需要合适的农杆菌浓度，即需要与真菌的孢子数目保持一定的比例关系。农杆菌浓度太小则相对于单个真菌孢子而言达不到转化所需要的浓度，浓度过大则可能会抑制孢子的生长,导致转化失败或者转化效率太低。

⑵ 乙酰丁香酮(acetosyingone, As)的浓度

共培养基中As能起到诱导活化农杆菌vir基因的作用，浓度太低会导致农杆菌病毒蛋白表达量不够，难以完成转化，AS浓度过大可能会导致T-DNA插入的拷贝数目增加。

⑶ 菌体浓度对转化效率的影响

转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。但其最高使用浓度有一定的界限, 当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子, 使转化效率降低。

⑷ 选择标记

以潮霉素磷酸转移酶 (hygromycin B phosphotransferase, hph) 基因作为选择标记基因。

⑸ 共培养时间对转化效率的影响

共培养时间的长短关系到农杆菌vir基因的表达及其蛋白的活化以及T-DNA的剪切和复合物向孢子内的转移,过短的共培养时间将导致转化无法顺利完成.但是共培养时间太长,非转化子对转化子生长的竞争作用将导致转化效率降低,加大假阳性出现的概率。

⑹ 共培养温度对转化效率的影响

共培养温度也是影响转化效率的重要因素, 已有研究发现22~25℃是最适的转化温度。

Reference：

[1] 黄亚丽,潘玮,蒋细良,郭平,田云龙,李记鹏,朱昌雄.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J].生物技术通报,2007(03):111-114.

[2] 迟彦,周东坡,平文祥,李姗姗,朱婧.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用[J].菌物学报,2005(04):142-149.

配100mM,甲醇先少量溶解再无菌水定容，0.1962g配10ml，200umol/l是使用在最后培养液的浓度，用的时候每1L加2ml,然后根据你配的量换算，比如100ml培养液就加200ul

【中药化学成分】：花蕾含挥发油即丁香油。油中主要含有丁香油酚（Eugenol）、乙酰丁香油酚、B-石竹烯（B一Caryophyllene），以及甲基正戊基酮、水杨酸甲酯、葎草烯（Humuleno）、苯甲醛、苄醇、间甲氧基苯甲醛、乙酸苄酯、胡椒酚（Chavicol）、a一衣兰烯（ａ一Ylangene）等。也有野生品种中不含丁香油酚（平常丁香油中含64～85％），而含丁香酮（Eugenone）和番樱桃素（Eugenin）。花中还含三萜化合物如齐墩果酸（Oleanolic acid、黄酮和对氧萘酮类鼠李素（Rham-netin）、山奈酚（Kaempferol）、番樱桃素、番樱桃素亭（Eugenitin）、异番樱桃素亭（Isoeugenitin）及其去甲基化合物异番樱桃酚（IsoeugenitoI）。

简述：治疗牙痛、支气管炎，神经痛、胃酸，抗呼吸系统及泌尿系统感染，减轻痢疾所造成之不适与疼痛，改善衰弱体质与贫血，催情（性无能、冷感），驱虫。促进血液循环，治疗皮肤溃疡及伤口发炎，治疗疥癣，改善粗糙肌肤。【中药化学鉴定】：（1）取粉末少许，滴加氯仿搅匀，再加3%氢氧化钠的氯化钠饱和液1滴，加盖玻片，放置片刻，有针状丁香酚钠结晶析出。（2）取切片直接滴加碱液，加盖玻片，可见油室内有针状丁香酚钠结晶形成。（3）薄层鉴别：取本品粉末0.5g，加乙醚5ml，振摇数分钟，过滤，滤液供试品溶液。另取丁香酚对照品，加乙醚制成对照品溶液。将两种溶液点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（9：1）展开，取出晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘干。可见供式液色谱与对照品溶液色谱在相同位置显相同颜色的斑点。[2]

【本质】似指甲状的红棕色花苞是精油的原料，树平均高度为５～６公尺左右，主要产地斯里兰卡、瓜哇、马达加斯加，以蒸馏法制得，其香味为有点鲜苔及木香的花香，是香水制造业不可缺少的香味，亦常加入酒中，精油颜色为透明无色。 不过这个酒不晓得是不是可以饮用的酒哦。不能乱猜的啊！！

根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，AT-MT）。根癌农杆菌（Agrobacterium tumeficiens）能够在受伤部位侵染植物，将其Ti质粒上的T-DNA（transfer DNA）转入植物细胞并整合进植物的基因组。根据农杆菌的这一特点根癌农杆菌介导植物细胞的转化已发展成为一种常用的遗传转化方法。除了转化植物细胞以外，ATMT对酵母、丝状真菌、动物细胞均实现了成功的转化。对丝状真菌转化来讲，传统的丝状真菌转化方法需制备原生质体，而ATMT对丝状真菌的转化可以孢子、菌丝等直接作为转化受体，操作更为简便。因此，ATMT在丝状真菌的转化中的应用日益广泛，并也被应用在对木霉菌的遗传转化中，已经成为最常用的转化真菌木霉的转化方法之一。

8.1.5.1 根癌农杆菌介导转化原理

根癌农杆菌介导木霉等真菌的转化原理同对植物的转化原理基本是一致的。已有研究表明，根癌农杆菌介导木霉等丝状真菌的遗传转化同样需要vir基因的表达。目前，对根癌农杆菌介导转化中参与外源基因转移的相关基因的转录和调控机理已研究得相当深入。其中，农杆菌Ti质粒上毒性基因vir的表达是完成遗传转化所必需的。在一些酚类化合物的作用下，例如乙酰丁香酮，诱导Ti质粒上vir基因的表达，合成T-DNA转移所需的一些蛋白质。它们编码的蛋白质产物参与单链T-DNA的合成、加工和转移等过程。

其中，VirA与VirG为调节蛋白，呈低水平的组成型表达，当外界存在酚类化合物例如乙酰丁香酮等诱导物时，可以激活由vir产生的VirA和VirG组成的双重调控系统。在特定单糖存在的情况下，染色体基因表达的蛋白质ChvE与VirA相互作用进一步增强了vir基因的表达水平。VirA是一种膜镶嵌蛋白，在乙酰丁香酮的作用下，能够自动磷酸化，活化后的VirG是一种DNA结合蛋白，作为转录激活因子，能进一步激活本身基因和vir区其他基因的表达。

T-DNA以单链的形式转入受体细胞，因此，首先是单链T-DNA的合成及加工，VirD编码的产物VirD1和VirD2参与其中。在VirD1协助下VirD2可与T-DNA两侧的边界重复序列的特定位点结合并切割产生缺口，止于左侧边界重复序列。在靠近右边界重复序列有一个25bp的强驱动序列，VirC1蛋白结合在这个地方，也刺激了T-DNA 单链的产生。随后，在DNA聚合酶的作用下，于缺口处进行单链T-DNA的复制，当复制进行到另一缺口时，T-DNA释放并与VirD2结合为VirD2/T-DNA复合体。

单链形成以后，T-DNA就会通过Ⅳ型的分泌机制，穿过细菌的细胞膜和细胞壁，VirB和VirD4蛋白参与了这个过程。VirB编码产物在细菌的表面形成转运孔道和T-pilus的结构。virD编码产物VirD4为膜嵌蛋白，介导VirD2/T-DNA复合体和VirB蛋白复合体的相互作用。VirD2/T-DNA组成的复合体及VirE2和VirE3通过IV型分泌机制转出细菌。

目前，对单链T-DNA复合物进入受体细胞的机制尚不清楚，但对由受体细胞质向细胞核的转移机制已有了一些初步的认识，VirD2和VirE3在其中发挥关键作用，这两种蛋白引导T-DNA进入受体细胞核，其中，VirD2含有核定位信号序列NLS，可以与宿主细胞的A核周蛋白（karypherin）发生作用而被转移到细胞核。同时，VirE3还可以与受体细胞中的A核周蛋白结合而通过依赖于A核周蛋白的途径被转运到受体细胞核中，从而引导T-DNA复合物进入细胞核。一旦进入细胞核内，T-DNA能稳定地整合到基因组中。T-DNA整合的具体机制现在还不很清楚，但宿主的蛋白质应起了重要的作用（Caroline et al.，2005）。

8.1.5.2 根癌农杆菌介导转化的步骤

（1）双元载体的构建。双元表达载体系统实际上就是一个质粒，双元载体包含两个部分，一个部分是能够被转移的T-DNA，另一个是能够帮助T-DNA转移的Vir区。转移区是有左右边界的，一般将含有合适真菌启动子和终止子的抗性基因插入T-DNA的两个边界序列之间，例如潮霉素B基因（hygromycin B phosphotransferase gene），在转基因时会在左右边界处断裂，只将左右边界以内的T-DNA区域整合到宿主基因组中。双元表达载体可以通过冻融法、三亲交配或电激法转化（大肠杆菌供体菌+大肠杆菌协助菌+根癌农杆菌受体菌），将构建好的质粒载体转入根癌农杆菌。根据目的的不同，构建的双元载体可分为两种类型：随机插入型和靶基因插入型的质粒载体。靶基因插入型的质粒载体要在抗性基因两端连接一段与目的基因序列同源并且长度合适的DNA片段，通过同源重组造成靶基因的突变。为了基因克隆，还可以在边界重复序列之间插入适当的克隆载体，使用质粒拯救和TAIL-PCR等方法从转化子中重新获得T-DNA和目标基因片段。

（2）根癌农杆菌的活化和培养。从YEP平板上挑取含有双元载体的根癌农杆菌单克隆菌落接种于含有合适抗生素的7mL YEP液体培养基中，250r/min，28℃过夜培养。次日，用诱导培养基IM（含200μM乙酰丁香酮）稀释到OD660为0.15，然后继续培养4～6h至OD660为0.6～0.8。

（3）共培养和转化子的筛选、鉴定。将100μL诱导活化的根癌农杆菌和等体积的木霉分生孢子悬液混合后均匀地涂布在含有200μM乙酰丁香酮的IM培养基平板上，28℃条件下培养48h，然后在IM培养基平板上覆盖一层含100μg/mL潮霉素（或其他抗生素）的PDA培养基（含有50μg/mL的四环素以杀死根癌农杆菌）。继续培养4～7d，将长出的转化子挑到含潮霉素培养基上进行筛选培养。将抗性菌转接到含药培养基上继续培养，提取基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交来鉴定疑似转化子及插入T-DNA的拷贝数。

8.1.5.3 影响根癌农杆菌介导遗传转化效率的因素

ATMT相对于其他转化方法，虽然具有转化效率高的特点，但其转化效率也同样受诸多因素的影响。这些因素包括根癌农杆菌菌株类型、转化受体类型、根癌农杆菌与受体的浓度、乙酰丁香酮的浓度和共培养环境条件（时间、温度、pH值）等。

ATMT受体材料来源广泛，不仅可以是原生质体，还可以是孢子、菌丝体及子实体组织等，从而扩大了农杆菌介导真菌转化的范围。但是个别真菌只能转化特定的类型。例如，ATMT对粗球孢子菌（Coccidioides immitis）只有以萌发的孢子作为初始材料才能转化成功，但对根霉菌（Rhizopus oryzae）和毛霉菌（Mucor circinelloides）只有以原生质体为初始材料才可。而对木霉来说，主要用分生孢子和菌丝作为转化的对象。但不同菌株的转化效率差别也是很大的。

常用于转化真菌的农杆菌菌株有AGL-1，EHA105，LBA1100，LBA4404及C58C1等，不同农杆菌菌株对转化效率的影响很大。对同一受体材料来说，不同农杆菌菌株对转化效率影响很大，例如，Kemppainen等（2005）发现对外生菌根生共体Laccaria bicolor来说，根癌农杆菌LBA1100和AGL-1转化效率相差4倍，AGL-1更适用。高兴喜等（2004）用AGL-1和LBA4404对 T.harzianum T88进行遗传转化发现，其中 LBA4404并不能转化T.harzianum T88，而AGL-1转化T.harzianum T88获得成功。综合相关报道可得出具有高Vir毒力的菌株，相对有较高的转化效率，而且不同菌株和载体类型对转化效率的影响还具有互作效应。

乙酰丁香酮（AS）是诱导农杆菌毒性基因表达的基本因素，也是转化成功与否的一个关键因素。AS在根癌农杆菌共培养期间是必需的。共培养前，利用AS对根癌农杆菌进行诱导培养，可以提高转化效率。其中，共培养基中AS的加入与否直接决定转化的成功与否，加入的浓度决定转化效率的高低；诱导过程中不加入AS会导致转化效率的降低。此外，共培养基中AS浓度会影响T-DNA插入的拷贝数，通常浓度过高会增加T-DNA插入拷贝数。如Mullins等（2001）在转化尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的过程中发现随着AS浓度的增加，T-DNA插入拷贝数也增加。

转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度也会影响转化效率。随着受体菌或农杆菌浓度的增加，转化效率会明显提高。但两者作用增长有一定限度，农杆菌过量会造成转化效率降低。而且高浓度的农杆菌共培养之后很难抑制其生长，从而影响转化子的生长。而受体菌浓度过高，会对转化子的挑取造成困难。

此外，共培养的环境条件（培养温度、时间和pH值）对转化效率也有一定的影响，共培养时间太短不能形成转化子，随着共培养时间的延长，转化子数目相应增加，对于木霉来说，由于生长过快，培养时间过长容易造成菌落重叠，不宜于菌落的筛选，一般共培养时间控制在24～48h之内。温度对转化率的影响没有共培养时间显著，温度范围一般为20～37℃，22～25℃为最佳温度。在比较高的温度下（＞28℃），根癌农杆菌不能很好地发挥其功能。共培养基的pH值对转化效率也有明显的影响，一般在pH值为6.0左右时效率较高，增加或降pH值都会使转化效率明显降低，尤其在高pH值条件下，转化效率更低，这可能是由于高pH值对毒性蛋白的表达有不良影响。例如，黄亚丽（2008）考察了共培养的环境条件对T.harzianum转化的影响，发现在一定范围内随着共培养时间的延长、温度的升高其转化效率明显增加。但是，时间过长、温度太高转化效率反而降低。以转化温度24℃为例，在共转化24h时转化效率为14个转化子/107个孢子，36h为200个转化子/107个孢子，48h转化效率最高为275个转化子/107个孢子，而当共转化时间延长到72h时，在共培养平板上木霉菌丝生长的过多，当转到抗性平板后在培养基上出现了大量的背景菌落，可能是因为潮霉素B不能杀死已经过多、过旺生长的木霉菌丝的缘故。共转化温度对转化效率的影响也存在拐点，在温度低时转化效率较低，随着温度的升高转化效率逐步提高，等达到一定温度后，再提高温度，转化效率反而会降低。这可能是因为温度过高或过低都不利于农杆菌毒性蛋白功能的发挥。对于pH值来说，共转化在pH值为5.3的环境中最适，增加或降低pH值都会使转化效率明显降低，当pH值高于6.5之后几乎没有任何转化子产生。

困境困苦之中，抑郁已久的心里情感，一朝得到释放，心中感到自由奔放，就好像纵放中的春天繁枝绿叶一样，处处充满生机。

药用丁香和观赏用的丁香花是两个截然不同的植物。药用丁香为双子叶植物药桃金娘科植物，味辛性温，气味芳香。功效为温中、暖肾、降逆。主治功效为呃逆、呕吐、反胃、痢疾、心腹冷痛、痃癖、疝气、癣症等。主产于坦桑尼亚、马来西亚、印度尼西亚等地。我国广东、广西等地有栽培。花蕾含挥发油即丁香油。油中主要含有丁香油酚（Eugenol）、乙酰丁香油酚、B-石竹烯（B一Caryophyllene）。

以及甲基正戊基酮、水杨酸甲酯、葎草烯（Humuleno）、苯甲醛、苄醇、间甲氧基苯甲醛、乙酸苄酯、胡椒酚（Chavicol）、a一衣兰烯（a一Ylangene）等。也有野生品种中不含丁香油酚（平常丁香油中含64～85%），而含丁香酮（Eugenone）和番樱桃素（Eugenin）。花中还含三萜化合物如齐墩果酸（Oleanolic acid、黄酮和对氧萘酮类鼠李素（Rham-netin）、山奈酚（Kaempferol）、番樱桃素。

番樱桃素亭（Eugenitin）、异番樱桃素亭（Isoeugenitin）及其去甲基化合物异番樱桃酚（IsoeugenitoI）。干燥的花蕾略呈短棒状，长1．5～2厘米，红棕色至暗棕色；下部为圆柱状略扁的萼管，长1～1.3厘米，宽约5毫米，厚约3毫米，基部渐狭小，表面粗糙，刻之有油渗出，萼管上端有4片三角形肥厚的萼；上部近圆球形，径约6毫米，具花瓣4片，互相抱合。将花蕾剖开，可见多数雄蕊，花丝向中心弯曲，中央有一粗壮直立的花柱，质坚实而重，入水即沉。

断面有油性，用指甲划之可见油质渗出；气强烈芳香，味辛。以个大、粗壮、鲜紫棕色、香气强烈、油多者为佳。

根癌农杆菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质——乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti质粒上的emphasis：role=italicviremphasis基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达。emphasis：role=italicviremphasis基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，转化植物根部细胞。

整个过程大致可分为以下几个步骤：①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；

②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；

③根癌农杆菌Ti质粒上的emphasis：role=italicviremphasis基因以及染色体上操纵子的活化；

④T-DNA复合体的产生；

⑤T-DNA复合体的转运；

⑥T-DNA整合到植物基因组中。

不知你的试验细节，不好分析原因。我们是这样做的，配制AS的时候，DMSO和水的比例是1：1溶解AS，比如你要配20mlAS，那就10mlDMSO完全溶解AS后再加10ml水混匀，4℃保存，通常AS配成1000x的母液，一升培养基加1mlAS，再倒平板。

温度越高越能溶解滴呀。

一、传统方法在菜薹种质创新中的应用

现有菜薹种质资源主要来源于常规途径，常规技术中应用最多的方法是系统选育法，即根据育种目标对原始材料中的不同株系进行多次选择、比较鉴定，筛选出优良的种质。利用这种方法，广东省广州市蔬菜科学研究所选育出四九心-19号，四九心-20号，其中四九心-19号产量比四九心增产1950～3900kg/ km2，叶色较深绿，主薹高度增加6～8cm，除耐热、耐湿外，还较耐霜霉病和菌核病，是目前菜薹常规品种中种植面积最大的早熟品种之一。十月红菜薹则是由胭脂红中发现的优良单株经过系谱选育而得，曾是湖北省的主栽品种，且被推广到长江流域各省。

华南农业大学植保系筛选出抗病毒病品种60天特青，然后对60天特青经单株选择的20多个不同株系进行田间比较，选出代号为8722的中花菜心品种，后来又对8722菜心进行优质、丰产、耐病毒病的系统选育，筛选出8722选菜心新品种。

油绿50天菜心则是利用四九菜心与50天菜心杂交选育的151菜心为母本，以60天菜心为父本，杂交后经过连续8代自交选育而成（张华等，2005）。

张华等（2005）于1999年利用迟心2号与60天油青菜心杂交，经连续6代自交系选出叶薹油绿、商品性较理想的油绿701品种。

雄性不育是高等植物中普遍存在的一种现象，十字花科芸薹属作物杂种优势明显，采用雄性不育系制种是此属作物利用杂种优势的主要途径之一。回交转育是获得优良雄性不育系的最常用的方法。李大忠（2002）从福州市地方菜薹品种七叶心自交后代中发现不育株。经过一代测交，三代回交后，不育株率稳定在50%左右，获得雄性不育两用系66A。用66A与小白菜杂交，杂种一代的一般性状偏向小白菜，表现出较强的生长优势，尤其是可食用部分较父母本增长了1～2倍；品质却偏向菜薹，略带甜味，柔软可口。赵利民等（2005）以大白菜CM S341127为不育胞质供体，以柳州早菜薹为受体，通过杂交、连续回交方法育成菜薹胞质雄性不育系TC12321。TC12321植株生长发育正常，不育性稳定，雌蕊功能正常，蜜腺发育健全，自然授粉结实良好，经济性状优良，配合力高，综合抗病性强。许明等（2003）利用大白菜核不育系9810721 作为不育源，以紫菜薹ZB3 为目标亲本，经过杂交、自交、兄妹交等转育手段，将雄性不育基因转育到紫菜薹中，获得紫菜薹“甲型”两用系、临时保持系和雄性不育系。而且笔者采用同样的方法，将核不育基因向菜薹品种转育，得到了含有早-49遗传基因的新甲型两用系、临时保持系和雄性不育系（许明等，2006）。王玉刚等（2005）亦通过杂交、自交等方法，将白菜雄性核不育性向菜薹可育品系03S001（翡翠油青菜心）中转育，获得了新的菜薹100 %核不育系及其相应的甲型两用系和临时保持系。

二、远缘杂交在菜薹种质创新中的应用

菜薹和油菜的AA组染色体相同，且其种间杂交有低度育性，为将油菜雄性不育基因转育到菜薹上提供了条件。刘胜洪等（2006）的试验表明：杂交后代的花药不育率为F1代＜BC1代＜BC3代，在BC3代群体植株中，不育率为94.60%，接近BC2代植株不育率水平，说明在不断的回交过程中，植株的不育率越来越高并相对稳定。

晏儒来、向长萍等（2000）于1988年开始向紫菜薹转育波里马油菜雄性不育系，以甘蓝型油菜和紫菜薹的杂种作母本，最初用大股子作转育亲本，经过4年6代的转育选择，于1992年秋从240个测交种中获得不育率达100%且性状相对稳定的材料3 份，即0-1、0-2-2、28-9 及其相应的保持系5 -1-4、5-1-3 和29-4-2。为了改良上述不育系的综合性状，1995年以抗病、早熟、耐热和菜薹无苦味为主要改良目标性状，选用了OF 系统（十月红2号×四九菜心）的一些早熟株系和十月红2号的一些株系为转育亲本。选用9405的F2 中19个不育株作母本杂交，在后代中坚持选不育率高的测交种，再从中选不育性彻底，生长势较强，早、中熟，抗病性强，且无苦味的不育株。经过3年6 代的选择，于1997年秋育成不育率达100%且综合性状较好的不育系9617、9630、9631 及其相应的保持系。其中9617 自播种至开始采收为40～45d，9630 为50d，9631 为55d左右。

刘自珠（1996）利用甘蓝型油菜雄性不育株为不育源、菜薹为转育父本，通过种间杂交、连续回交，选育出菜薹胞质雄性不育系002-8-20A及相应的保持系049-20B。该不育系结实正常，不育株率和不育度达到93%以上，已用于杂种一代组合的配制。

张成合等（2003）将菜薹同源三倍体与二倍体相互杂交，3x×2x的结籽率为34.78%，2x×3x的结籽率为26.17%。经染色体检查，杂交子代植株绝大多数为非整倍体，其中三体植株占33.3%（3x×2x）和40.70%（2x×3x）。经细胞学鉴定和核型分析，从三体植株中初步鉴定出三体3、三体7、三体8和三体9 等4 种初级三体。这些都是难得的遗传材料。

黄邦全等（1999）通过种间杂交将Ogura 萝卜雄性不育细胞质导入了紫菜薹，通过连续回交获得了叶色正常、蜜腺正常的紫菜薹Ogura细胞质雄性不育系。黄邦全（2002）以Ogura细胞质雄性不育紫菜薹（AA，2n=20）为母本，以不同萝卜品种（RR，2n=18）为父本进行杂交，获得了大量的属间杂种。杂种F1幼苗在低温下子叶及真叶均不缺绿，以红萝卜为父本获得的杂种F1植株叶柄、叶脉呈紫红色；以白萝卜为父本获得的杂种F1植株叶柄和叶脉不呈紫红色。所有的杂种F1植株都开白花，蜜腺正常。雄配子高度不育，但是雌配子具有部分育性。杂种F1花粉母细胞的染色体数目为预期的2n=19，染色体平均配对构型为15.53Ⅰ＋1.34Ⅱ＋0.25Ⅲ＋0.01Ⅳ，多数染色体以单价体的形式存在，但也有一些二价体、三价体甚至四价体，最多达到6Ⅰ＋3Ⅱ＋1Ⅳ，参加配对的染色体数达13条，表明A染色体组和R染色体组具有一定的同源性，萝卜染色体上的有利基因可以通过部分同源重组或者代换进入到紫菜薹中。同时，在F1中发现了2株染色体自然加倍的双二倍体。双二倍体与未加倍的杂种F1都表现为父本萝卜的白花性状，蜜腺正常，低温下子叶不黄化。虽然双二倍体在减数分裂过程中能形成具有19条染色体的配子，双二倍体的花药比未加倍的杂种F1发育要好得多，但是双二倍体的育性还是低于未加倍的杂种F1。尽管未加倍的杂种F1在减数分裂时多数染色体以单价体的形式存在，同时也有二价体、三价体甚至四价体的形成，并且存在落后染色体和染色体桥。

黄邦全（2002）以OguraCMS紫菜薹×萝卜杂种F1（AR，2n=19）为母本，以甘蓝型油菜（AACC，2n=38）为父本进行杂交，获得了8 株杂种植株。其中1株（PRN-1）的花色为嵌合体，该植株上的花多为黄色，但是也有乳白色花，另外还有1朵花甚至1个花瓣上同时具有黄色和白色区域，其余3株（PRN-2、PRN-3、PRN-4）都开白花。PRN-4的花药开花前退化，其余3株都可以看到3～6枚花药，能够产生部分花粉，但是PRN-2的花粉不能被I2-KI溶液染色。PRN-2具有4个蜜腺，PRN-1和PRN-3具有2个蜜腺，PRN-4无可见蜜腺。在低温下，PRN-2叶色正常，其余3株幼叶表现不同程度缺绿。PRN-1的染色体数目为2n=38，PNR-2的染色体数目为2n=35，PRN-3的染色体数目为33，PRN-4的染色体数目未能确定。它们的染色体平均配对构型各不相同。与甘蓝型油菜回交后，PRN-1、PRN-2、PRN-3 植株各自产生了一定数量的种子，而PRN-4则未产生种子。

梁红等（1994）用杂种胚离体培养的方法获得了菜薹与甘蓝的正反交F1代。杂种一代的一般性状介于两亲本之间，偏向父本，并表现出强烈的生长优势。其蛋白质含量普遍超亲，游离氨基酸含量和还原糖含量介于两亲本之间，或超过高亲亲本。

郑岩松等（2003）研究了芥蓝以及芥蓝×菜薹种间杂种后代对芜菁花叶病毒（TuMV）油菜株系的抗性。结果表明，芥蓝对广东省广州地区TuMV油菜株系具有近于免疫的抗性。芥蓝×菜薹种间杂种回交后代抗TuMV油菜株系的选择效应受回交亲本影响很大：用抗病品种与杂种回交的后代，经两次系统选择后，已获得16个经济性状较好的抗病品系；但用感病品种与杂种回交两代之后，抗病性明显下降。

三、物理化学诱变在菜薹种质创新中的应用

诱变育种是利用理化因素诱发植物发生变异，通过选择育成新品种的方法。

尚爱芹等（1999）利用不同浓度的秋水仙素对二倍体菜薹种子和幼苗生长点进行不同时间长度的浸泡，结果表明，用0.1%秋水仙素水溶液处理幼苗生长点48h的诱变效果最好，诱变率可达26.67%，浸泡种子效果不佳，最高诱变率仅为4.0%。四倍体植株结籽率较二倍体明显降低，平均达42.3%，而八倍体植株几乎是完全不育的。随着染色体组的增加，花粉粒大小和叶片保卫细胞中的叶绿体数均显著增加，与二倍体（CK）比较，四倍体植株生长旺盛，花薹的产量和品质均有所提高。

廖飞雄等（2001）利用60Co-γ射线辐射菜薹种子，发现对预先浸泡1h的菜薹种子来说，适宜的处理剂量为200～300Gy。廖飞雄等（2003）对60Co-γ射线辐射后的菜薹器官进行离体培养时，发现对菜薹种子的适宜辐射剂量是200Gy左右，经过催芽的种子适宜剂量为50～100Gy，离体培养茎尖可用40～70Gy。

四、生物技术在菜薹种质创新中的应用

（一）体细胞变异体离体筛选

组织培养得到的再生植株以一定频率发生变异是一种普遍的现象，这便是利用植物体细胞变异体离体选择法对作物现有品种进行有限的修饰与改良的基础。通过这种方法，已成功地筛选出耐盐水稻、抗稻瘟病细胞突变体、抗除草剂大豆等一系列有价值的突变体，在作物遗传改良方面发挥了重要作用。在植物耐热性筛选研究中与传统的耐热性选择方法相比，离体筛选方法具有不受季节和气候条件限制、变异范围广、选择群体大、节省土地和人力等特点，可显著提高种质资源创新的效率。

何晓明等（1999）进行了菜薹耐热性离体筛选的研究，结果表明，耐热性不同的菜薹品种对离体培养中的热胁迫反应亦有所差异，35℃培养30d的无菌苗存活率可以作为菜薹耐热离体筛选的选择指标。通过热胁迫交替选择，从热敏菜薹品种中，初步筛选出3个耐热无性系A -2、B -1、B -8。这些无性系耐热品系在热胁迫中的茎尖存活率基本保持在60%～80%，而未经筛选的无性系茎尖的存活率平均仅为20. 83%，因此经过筛选的无性系的耐热性有了明显改善。同时还发现，经9 代培养和4次热胁迫筛选，这3个无性系的耐热性均表现比较稳定，表明这种耐热性可以在无性繁殖过程中传递下去。通过热胁迫选出的无性系其茎尖繁殖系数也较原群体有所提高。

廖飞雄等（2003）在离体筛选耐羟脯氨酸变异的研究中，发现对菜薹茎尖和愈伤组织来说，经0.3mg/ml的羟脯氨酸3～4个周期筛选后，可获稳定抗性株系。菜薹种子萌发后的幼苗在1.0mg/ml浓度上，经4个世代连续筛选可获抗性株系。3mg/ml浓度可用于幼苗的前期淘汰。入选系耐羟脯氨酸的能力和耐热性提高。廖飞雄等（2004）利用“六十天特青，离体筛选出的一个菜薹耐羟脯氨酸选择系Hypr01，发现在人工气候箱模拟栽培高温逆境下，Hypr01和未经选择的六十天特青相比，有较强的耐热性。

（二）基因工程

徐秉芳等（1996）研究报道紫菜薹的花粉经低温水合、热激、渗激三步程序，分离出大量具萌发能力的脱外壁花粉，脱外壁率可高达60%以上。在含有碳源与氮源及Roberts 培养基盐成分的碱性PEG培养基中，首次使芸薹属脱外壁花粉萌发，萌发率可达41%。这使得利用花粉作为外源基因的媒介进行植物遗传的转化有了重要的突破。

施华中（1995）以花粉特异启动子Zm13-260 控制的Gus 基因作为报告基因，用电激法分别转化紫菜薹花粉原生质体和花粉粒，通过瞬间表达检测，比较了二者的转化效果。结果表明，花粉原生质体的电激导入效果比花粉粒高，前者的Gus 基因瞬间表达水平远远高于后者，Gus 基因活性是后者的10倍。并探讨了Gus 基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达特性，花粉愈幼嫩，Zm13 的启动活性愈低。

张国裕等（2006）以建立的菜薹高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮（A S）、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜薹（B rassica camp estris L. var. pchinesis）子叶遗传转化的影响，探讨了适宜菜薹转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明，农杆菌菌株A GL0 对菜薹的浸染能力最强，添加乙酰丁香酮有利于菜薹转化；子叶外植体预培养2d 后浸染（菌液浓度OD 600值为0.8）15min，共培养2d，然后转移到含15mg/L 卡那霉素和100mg/L T icarcillin 的筛选培养基上，进行转化植株的再生，植株再生率及外植体GUS 阳性率均较高，是较优的转化条件；该试验共获得8 株转化植株，转化率达2.44%，经PCR分析和Southern 杂交检测表明，Gus基因已整合进入菜薹基因组。

张扬勇等（2003）通过对农杆菌介导法将韧皮部特异表达启动子RSs-1（Rice sucrose synthase-1，水稻蔗糖合成酶）与雪花莲凝集素（Galanthus nivalid agglutinin，GNA）基因构成的嵌合基因转化菜薹，获得转基因植株。该试验目的是利用雪花莲凝集素对刺吸式昆虫有较好的抗虫效果，采用延迟筛选抗生芽的方式，最终得到了抗生植株，并通过了分子检测。

通过基因工程的手段进行菜薹种质的创新还刚刚起步，随着菜薹转基因体系的逐步完善以及克隆的有用基因越来越多，该技术在菜薹种质改良中的应用将越来越广泛。