浮游植物定量及叶绿素a 测定
2.4.2.1 浮游植物定量
个体计数仍是目前常用的浮游生物定量方法。计数浮游生物时，需使用计数框来限定待计数样品的体积或面积，计数框的长、宽、高 (深) 用测微尺或卡尺准确测量。常用计数框有0.1 mL 和1 mL 两种。计数前要将样品充分摇匀，然后用滴管在水样中部吸液移入计数框内。移入之前要将盖玻片斜盖在计数框上，样品按准确定量注入，在计数框中一边进样，另一边出气，这样可避免气泡产生，注满后把盖玻片移正。计数片子制成后，稍候几分钟，让浮游植物沉至框底，然后计数。不易下沉到框底的生物，则要另行计数，并加到总数之内。浮游植物计数时，吸取 0.1 mL 样品注入 0.1 mL 计数框，在 10 × 40 或8 × 40倍显微镜下计数，藻类计数 200 个视野，计数两片取其平均值。如两片计数结果个数相差 15%以上，则进行第三片计数，取其中个数相近的两片平均值。
藻类计数亦可用长条计数法，选取两相邻刻度从计数框的左边计数到计数框的右边成为一个长条。在长条计数法时，方格的底边和顶边分别为计数边和不计数边，统计移过中心垂线的浮游生物。与底边刻度相交的个体，应计数在内，与顶边相交的个体，不计入在内，与底边和顶边刻度都相交的个体，以生物体的中心位置作为判断的标准，也可以在低倍镜下，按上述原则单独计数，最后加入总数之中。计数时，首先旋转目镜的位置使中心线与计数框的一边重叠，再移动载物台，逐步计数。也可用直尺式目镜测微尺进行长条计数，即直尺相当于中心垂线，顶端刻度相当于顶边，底端刻度相当于底边。一般计数 3条，即第 2、5、8 条，若藻体数量太少，则应全片计数。硅藻细胞破壳不计数，硅藻细胞空壳可按中心纲和羽纹纲分别单独计数，但不加入总数之中，仅用于硅藻计数的校正。若计数种属的组成，分类计数200个藻体以上。用划“正”字的方法，则每划代表一个个体，记录每个种属的个体数。个体计数时，单细胞者一个细胞为一个体，定形群体者一群为一个体，不定形群体者按视野内的具体分散状态各定为一个体。本书研究采用长条计数法。
把计数所得结果按下式换算成每升水中浮游植物的数量:
煤矿塌陷塘环境生态学研究
式中:N为每升水中浮游植物的数量(ind/L)A为计数框面积AC为计数面积(mm2)，即视野面积×视野数或长条长度×参与计数的长条宽度×镜检的长条数VW为1L水样经沉淀浓缩后的样品体积(mL)V为计数框体积(mL)n为计数所得的浮游植物的个体数或细胞数。
2.4.2.2 叶绿素a测定
叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素a，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化指标之一。
(1)水样的采集与保存
可根据工作需要进行分层采样或混合采样。湖泊、水库采样500mL，池塘300mL，采样量视浮游植物量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000mL。采样点及采样时间同“浮游植物”。
水样采集后放在阴凉处，避免日光直射。并立即进行测定前的预处理，如需经过一段时间(4～48h)方可进行预处理，则将水样保存在低温(0～4℃)避光处。在每升水中加入1%碳酸镁悬浊液1mL，以防止酸化引起色素溶解。水样在冰冻情况下(-20℃)最长可以保存30d。
(2)仪器设备
进行叶绿素a的测定时，所需的仪器设备有:分光光度计、真空泵、离心机、乙酸纤维滤膜(孔径0.45um)、抽滤器、组织研磨器或其他细胞破碎器、碳酸镁粉末、90%丙酮。
(3)实验步骤
1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大(约为50kPa)。水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。如需短期保存1～2d，可放入普通冰箱冷冻，如须长期保存(30d)，则放入低温冰箱(-20℃)保存。
2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3mL的90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机(3000～4000r/min)离心10min，将上清液倒入5mL或10mL容量瓶中。
3)再用2～3mL的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为5mL或10mL，摇匀。
4)将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。即以663nm、645nm、630nm波长的吸光度依次减去750nm的吸光度，作为这3个波长的真正吸光度。
(4)计算方法
叶绿素a的含量按如下公式计算:
叶绿素a(mg/L)=
煤矿塌陷塘环境生态学研究
式中:D为吸光度V1为提取液定容后的体积(mL)V为水样体积(L)δ为比色皿光程(cm)。
下午好，乙酸纤维素膜是亲水的水相，对于大于其孔径的有机物起截留作用，对小于其孔径的有机物不做任何改变，但含有部份极性有机溶剂的水相例外，比如含有THF、DMSO或者BCS等水溶性溶剂，它们会溶解纤维素膜造成孔径溶融，会对过滤后的纯净水相内物质浓度造成一定的影响的，请注意。一般我们过滤水相和有机相都是统一使用聚丙烯。
有四个甲基与卟吩核连接（R= —CH3）。蜡状蓝黑色微小晶体。熔点117-120℃。溶于乙醇、乙醚、丙桐、氯仿、二硫化碳和苯。不溶于石油醚。乙醇溶液是蓝绿色，并有深红色荧光。
浑浊当然要过滤啦.实验室用过滤杂质的也可以吧~
一、目的要求
学习使用滤膜法测定水中大肠菌群。
二、基本原理
滤膜法是采用滤膜过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，其孔径约0.45μm。
三、器材
伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋白胨发酵管内有倒置小套管），灭菌水，河水或湖水；
灭菌过滤器（漏斗、基座、带有孔橡皮塞的抽滤瓶分别灭菌，可用高压蒸汽灭菌），镊子，夹钳，真空泵，滤膜，烧杯等。
四、操作步骤
1.滤膜灭菌
将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
2.滤膜过滤器装置
用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶按图ⅪⅤ-2装配好，其中滤膜用灭菌镊子（浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌）移至过滤器的基座上。其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
3.将抽滤瓶接上真空泵。
4.加水样过滤
直径35mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数不图ⅪⅤ-2滤膜过滤器装置多于50个为适宜。一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。本次实验于过滤器漏斗内加入比较清洁的河水或湖水100ml，加盖。
5.开动真空泵进行油滤。
6.抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
7.滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在远藤氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板上。滤膜与培养基之间不得有气泡。
8.将平板倒置于37℃下培养22—24小时。
9.挑取符合大肠菌群菌落特征（参阅实验六十）的菌落，进行革兰氏染色、镜检。
10.将镜检为革兰氏阴性、无芽胞杆菌的菌落再接种一支乳糖蛋白胨发酵管，经37℃培养 24小时，产酸又产气者即为大肠菌群阳性。
11.计算
1升水样中的大肠菌群数
=滤膜上的大肠菌群菌落数×10
醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一-细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好。太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。
