乙醇沉淀蛋白质有哪些注意事项

乙醇引起的变性与沉淀

先加入蛋白液溶解，加入NaCl（盐析）降低蛋白质溶解度，形成过饱和溶液，再加入乙醇现象会更明显些。

变性的蛋白质是不会再溶于稀酸或稀碱了，应为变性即意味着结构的永久改变。你的试验中乙醇的最终浓度是95%*1ml/3ml=32%，而且最后蛋白会再溶解。因此，这个实验不足以证明蛋白质变性。

变性原因

变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。

以上内容参考：百度百科-蛋白质变性

盐析法——多用于各种蛋白质和酶的分离纯化

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析.常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等.各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离.例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性.调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好.盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等.针对温度这一条,需要强调：在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加.但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降.在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行.

使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用.另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH.

2.有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3)在生化制备中应用比盐析法广泛.但是,在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性.例如酒精消毒灭菌就是如此.因此,操作要求在低温下进行.有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

3.等电点沉淀法——此法单独应用较少,多与其它方法结合使用；

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时

这个问题太笼统了，由于糖蛋白中糖含量可以由90%以上到1%以下，只要含有糖和蛋白且以共价键连接都可以叫糖蛋白，糖含量较多的当然性质就像糖，蛋白含量占主要的就和蛋白的性质相近。无水乙醇是可以沉淀蛋白的，在我们具体操作中，也可以用乙醇来沉淀多糖，所以，原理上说，无水乙醇是可以沉淀糖蛋白的，但是大多是大分子的，分子量过小的话很难沉淀下来

这涉及到等电点的问题，乙醇和蛋白质反应变性后，加入乙酸，会使ph值和pi值相近，此时溶解度最小，沉淀析出，所以加乙酸产生更多的沉淀，而蛋白质与重金属时，ph大于pi，蛋白质成阴离子和金属阳离子结合生成沉淀，加入乙酸，ph减小，阳离子增多，阴离子减小，与金属阳离子结合减少，生成沉淀减少，所以一个加入乙酸沉淀增多，一个加入乙酸反而减少。

乙醇沉淀蛋白实际上是乙醇在水中的溶解度比蛋白质大，高比例的乙醇和蛋白质争夺水分子破坏了蛋白质表面的水膜，使得蛋白质沉淀下来。实质上此时的蛋白质并未彻底变性，仅仅是失水而已。在重新获得水后还是可以复性的，就和冻干成干粉的蛋白重新溶解到水中是一样的。但这个也不是绝对的，主要是看目标蛋白或者多肽的特性，有些蛋白对有机试剂非常敏感，沉淀后不一定能够正常的复性。此外一点是，蛋白质和活性多肽提取没有一个方法能够保证所提取的所有类型的蛋白都能保证活性。所以，关键一点是根据目标蛋白的性质来选择不同的分离手段。

蛋白质加入乙醇一般不会发生沉淀（网络上资料说会沉淀的很多，个人认为不会，好像在哪做过这样的题目，因为人体也有蛋白质，如果乙醇会使蛋白质变性发生沉淀，那人喝酒一定会引发出一些不良的结果。

强碱会是蛋白质变性产生沉淀。

那个人说氢氧化钠不溶于乙醇使错误的，氢氧化钠使可以溶于乙醇，仍具有很强的碱性。