磁珠包被原理

一氪生物磁珠法核酸纯化试剂

1纯化反应干扰物

干扰物有高浓度蛋白、BSA，这两种物质会导致磁珠聚沉，从而影响纯化效率，需要添加SDS处理后进行纯化。

2片段选择性能准确性干扰物

干扰物有yichun，异Bing醇，聚乙er醇，会影响片段选择回收效果，需要上调或下调磁珠使用量。

3回收片段大小限制：

大小范围为100bp-20kb，超范围片段回收效率将显著降低。

4应用范围限制：

仅用于常规分子生物学反应溶液中的DNA的纯化，磁珠不含裂解细胞及蛋白成分，不可用于组织、细胞、血浆等生物样本的DNA提取。

5原有过膜纯化方法更换为磁珠纯化方法可能带来的预期外影响

磁珠法纯化不同于过膜法纯化的原理，在替换的过程中可能预见的问题主要有：

1)磁珠法纯化中，纯化产物会存在痕量的反应液残留。

2)纯化片段大小可能发生变化

评价检测方法：

1)杂质残留影响，建议进行试用评估及测试，检测最终结果。

一般的二代测序文库构建过程中，末端修复、3‘端加A、及接头连接反应中应用磁珠法纯化，痕量残留不会对后续反应造成影响。

2)有特殊片段大小需求的情况下，可根据目标片段大小选择适宜的纯化磁珠用量。

磁珠法核酸提取过程：

1、裂解

取抗凝全血到1.5mLEP管中，加入BufferA、BufferB，混合均匀。然后把EP管置于恒温水箱中温育15～20min。

2、结合 

    将EP管从温育设备中取出，离心后取上清，加入振荡混匀的磁珠结合液，颠倒混匀。将EP管置于磁力架上进行磁分离，弃废液（吸净管盖及管底残液）。

3、洗涤 

⑴ 加入洗涤液Ⅰ，点振数次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；

⑵ 加入洗涤液Ⅱ，点振数次（若有团状或丝状物可增加点振次数及力度），然后磁分离，吸净管盖及管底的残液；

⑶ 重复步骤⑵一次；

⑷ 室温下开盖干燥。

4、洗脱 

加入洗脱液，放置水浴锅中温育后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验。

◎操作简便快速，可在30分钟内获得理想的核酸，适用于较多样本的批量提取；

◎提取核酸纯度高，无抑制剂，A260/A280为1.8-2.0；

◎采用自主研发的改性硅基磁珠，同样的样本量提取的核酸更多。

产品介绍

BIOG Routine NA Mag-B Kit是常州百代生物科技股份有限公司研制的专门用于提取口腔拭子、泌尿生殖道拭子、细胞悬液、组织悬液、唾液、尿液和水样等样本核酸的试剂盒。BIOG Swab NA采用独特的裂解液配方，细胞裂解快速彻底，核酸提取效率高。试剂盒采用了我们自己研发的改性硅基磁珠，核酸吸附能力强，提取核酸纯度高。试剂盒操作简便快速，特别适用于一次试验较多样本的批量提取。与同类产品相比，提取得到的核酸纯度更高，产量更大，最大限度地去除了蛋白、色素、脂类、杂质污染，可以直接应用于各种PCR检测和常规分子生物学实验。

操作步骤

1. 请自行准备：无水乙醇、异丙醇、1.5mL离心管。

2. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液A：按终浓度30%的比例加入无水乙醇，如21mL加入9mL无水乙醇；42mL加入18mL无水乙醇，混匀。

b) 洗涤液B：按终浓度70%的比例加入无水乙醇，如9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇，混匀。

c) 请按需配制洗涤液，尽量不要多配。配制后的洗涤液如一次使用不完，可严格密封后放于室温阴凉处保存，1周内使用完毕。

3. 取1.5mL离心管，加入0.2mL 裂解液、20μL 消化液，再加入0.2mL样本，振荡混匀，65℃温育10 分钟。

4. 冷却到室温，加入0.2mL异丙醇，充分混匀。再加入20μL磁珠复合液（每次使用前须充分混匀），振荡混匀3min（注意不要颠倒混匀，以防磁珠粘附于管盖内壁）。

5. 将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。.

6. 加入0.5mL配制后的洗涤液A，将离心管从磁力架上取下，中速振荡2min，确保磁珠完全分散。再将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。

7. 加入0.5mL配制后的洗涤液B，将离心管从磁力架上取下，中速振荡2min，确保磁珠完全分散。再将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。

8. 将离心管从磁力架上取下，开盖，干燥约3-5min，至无明显乙醇气味 (注意乙醇要挥发干净)。

9. 加入40 μL洗脱液，振荡至磁珠充分散开，60℃温育2min，振荡混匀30 sec。

10. 将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，小心吸取上清液至一新的1.5mL离心管中，提取的核酸可直接用于下游实验，或-70℃保存

备用。

注意事项：

1、本试剂盒与1.5mL离心管磁力架配套使用，可选用BIOG 多功能通用磁力架。

2、本试剂可用于DNA提取，也可用于RNA提取，试剂盒内液体已经去RNA酶处理，但如用于RNA提取，实验所用器具也应除去RNA

酶，实验中最好戴一次性洁净手套、口罩，提取的RNA溶液可适当加入RNA保护因子（货号：51090，一般50μLRNA溶液加入3μL。）

3. 裂解液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻，洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀。

核酸作为一种生物大分子，之所以能够在水溶液中稳定分散不沉淀，是由于三种非共价作用力的存在：（1）静电相互作用（2）范德华力（3）氢键。核酸分子具有多个磷酸基团，呈现高度负电性，分子间互相排斥从而避免发生团聚。此外，核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围，形成一个水化层，也阻止了分子间的聚集。因此，要使得核酸分子结合到磁珠表面，就必须削弱上述作用力，屏蔽溶液中的静电斥力，同时破坏核酸分子表面的水化层，使其能够与磁珠表面相接触，进而产生吸附。

国内目前生产磁珠法核酸提取试剂盒的厂家大小百余家，所用的磁珠按照表面性质可分为以下三类：

这是一类使用最为广泛的磁珠。使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐（NaI、NaClO4、GuHCl、GuSCN等）。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时，离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合，破坏二者表面原有的水化层，促进磁珠表面与核酸分子的吸附（氢键+范德华力）。由于常用的离液盐如胍基离子对PCR有抑制作用，因此它们必须在后续的洗涤步骤中被去除，去除效果可通过吸光度比值进行监控。

这类磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外，还能通过另一种特殊的机制与核酸分子结合。通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl，可以使得核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩成小球状，其上的负电荷也大部分被屏蔽掉，促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大，越倾向于发生这种从伸展线团向蜷缩小球的构象变化，因此， 通过调节盐溶液与核酸样本的体积比，能够实现较大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的优先吸附，达到所谓的片段筛选效应。

此类磁珠能够方便地通过调节pH实现核酸分子在表面的可逆结合。不过，由于正电荷表面对核酸分子吸附过强，容易导致收率偏低，因此正电荷磁珠的使用反而不如硅羟基及羧基磁珠广泛。

admin 2022-06-16 06:16:13 8次

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。

用于单细胞测序的细胞条码化

1.相关申请的交叉引用

2.本技术要求2019年11月4日提交的，题为“用于单细胞测序的细胞条码化”的第62/930,288号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用纳入本文，用于所有目的。

3.发明背景

4.目前的液滴微流体方法实现了数千细胞的通量。然而，更大的数量可能难以实现。使用微流体技术，至少有三个导致细胞悬浮液死体积和因此用于分析的细胞丢失的因素：1)微流体装置的入口处的剩余液体2)微流体通道预划分中的剩余液体和3)未从微流体装置的出口处收集的材料。此外，非常大的液滴乳化体积，对应于高细胞通量实验，很难以及时的方式产生，由于所需的体积。这可能对于细胞活力和细胞内含有的不稳定的核酸底物(如rna)有不利影响。最后，当产生较大的液滴乳液时，其增加的体积使其难以将单个乳液装载入与热循环仪兼容的单管中，从而进一步限制了大乳液体积的实施。

5.单细胞条码化平台需要昂贵的微流体技术(芯片、油和仪器)和条形码珠。仪器还需要昂贵的现场服务工程师来维护和解决硬件问题。

6.虽然液滴微流体技术改进了可扩展性，除非使用更复杂的芯片上(on-chip)液滴合并和皮注射(picoinjection)功能，否则只支持添加一种溶液。

7.用寡核苷酸直接标记细胞是使用寡聚物-偶联珠的选择。然而，在不破坏细胞生理的情况下，装载到细胞上的寡核苷酸的最大数量约为100-1000万。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的终浓度往往将不足以驱动分子生物学反应，因此阻止液滴与直接寡核苷酸标记的细胞兼容。

8.发明概述

9.高密度寡核苷酸，范围达到106至107个分子，可以通过各种方法附接至细胞。例如，可以通过细胞特异性寡核苷酸偶联抗体(stoeckius等2018，genome biology)或通过脂质修饰的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)标记细胞。寡核苷酸细胞附接创造了直接在细胞上构建细胞条形码的可能性，例如，通过拆分汇集条形码构建(fan等2015，science)。这些细胞条形码反过来可以用于条码化靶向的细胞的核酸底物。

10.以前，这种形式的细胞条码化的一个要求是，在寡核苷酸裂解或从细胞释放之前，细胞与附接细胞条形码寡核苷酸的互补物必须被共同限制在分区中，此时可以发生与细胞核酸底物的附接。虽然液滴提供划分格式用于这种类型的反应，但是存在一些缺点。首先，单个乳液中液滴的数量上限是约100-200万。为了尽量减少多个细胞共同定位于单个液滴中，可以以大约0.05-0.1的λ装载细胞。基于每个乳液的液滴数量，封装的细胞的数量被限制在最大50,000至100,000。这种细胞通量对于某些类型的实验可能是不足够的，且受到向上可扩展性的限制。第二，由于入口处、微流体和液滴中剩余的细胞悬浮液不能从出口处收获，使用液滴微流体技术的细胞损失很难消除，导致细胞利用率为约60-85％。对于珍贵的细胞，这种水平的细胞利用率可能是不足够的。第三，液滴微流体技术需要芯片、油和仪器，都昂贵且难以支持。第四，在已经形成的液滴中加入试剂并在保持液滴的同时洗涤产物，虽然通过皮注射、液滴合并和磁珠捕获方法是可行的，但不容易工程化。这种限制使得单细胞

dna分析困难，因为简单的液滴微流体技术不支持蛋白酶k消化、随后失活然后加入生物化学品。第五，因为只有100-1000万寡核苷酸可以在不破坏膜的情况下被装载到细胞上，液滴必须有几十pl的体积，以提供足够的寡聚物浓度以驱动分子生物学反应。这些小液滴可能很难通过两个水性入口的微流体技术实现。第六，在进行条码化反应之前，细胞通常必须被清洗以除去其培养基。这明显增加了细胞损失。

11.本方法用液滴解决了上述限制，如下：在细胞上建立细胞条形码后，用与细胞密度匹配的水凝胶溶液重悬细胞，使得细胞不沉降。这可以通过用于保持细胞悬浮的常用试剂实现，例如蔗糖缓冲、percoll(西格玛(sigma))和/或optiprep(西格玛)。然后接着发生水凝胶的固化(solidification)。固化背后的机制取决于用于水凝胶的材料。例如，琼脂糖的固化会由温度下降引起。或者，藻酸盐可以使用钙交联。或者，temed启动了聚丙烯酰胺单体的交联。因此，细胞被分散在整个固化的水凝胶基质中。

12.水凝胶可以经或不经修饰以结合细胞条形码寡核苷酸。例如，细胞条形码寡核苷酸可以在5’端用生物素修饰，亲和素类似物(例如链霉亲和素)可以被偶联至水凝胶材料。因此，当在溶液中时，带有结合的寡核苷酸的细胞将自由移动，然而，一旦水凝胶固化，任何释放的寡核苷酸将在细胞膜的直接的附近结合至基质，在细胞膜存在的地方形成壳或皮。例如，0.01至10％重量/体积(wt/vol)的水凝胶对离子和非离子去污剂、以及低分子量蛋白质、酶和辅因子是多孔的。因此，在将细胞捕获在水凝胶基质中之后，细胞裂解剂(例如0.1％np-40)可以被应用于细胞。裂解剂将通过基质扩散并裂解细胞。细胞条形码寡核苷酸裂解或释放将作为细胞裂解和膜溶解的直接结果发生，或通过特异性或非特异性试剂从细胞裂解或释放寡核苷酸。然后释放的细胞底物核酸将结合至细胞条形码寡核苷酸，其已经被固定在细胞膜/水凝胶界面的壳中。

13.通过细胞/水凝胶界面圈起来的区域的体积基本上是细胞的体积。无论细胞条形码寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的壳上，这种最小体积将显著增加细胞条形码寡核苷酸的有效浓度，达到最大值。这可以补偿，例如，对于在不影响细胞生理的情况下可以被装载到细胞上的细胞条形码寡核苷酸数量有限，例如，每个细胞100-1000万寡核苷酸。对于直径约为9微米的细胞，用200万寡核苷酸的有效浓度将是几百个nm，其为足以支持大多数分子生物学反应(例如逆转录)的浓度。低分子量rna或dna依赖性聚合酶可以与裂解剂一起或之后加入，也可以在中间的洗涤之后加入，以除去或灭活细胞裂解剂。

14.一旦细胞底物核酸加细胞条形码寡核苷酸标签，导致细胞条码化发生，在从固化或未固化的水凝胶基质除去材料之后，文库制备的最后步骤可以在水凝胶基质中或溶液中发生。例如，逆转录酶，由于其低分子量，将流经组合物中高达5％的水凝胶。将其与裂解剂一起，或是与或不与寡核苷酸裂解/释放剂一起应用，将导致以下事件。随着裂解剂溶解细胞膜，细胞条形码寡核苷酸将结合至水凝胶以在细胞膜存在的位置形成壳。释放的rna将结合至在细胞膜存在的壳上固定的寡核苷酸，逆转录酶将合成cdna。这就是条码化反应。一旦发生，水凝胶可以被溶解，制备ngs文库的最终步骤就可以批量完成。

15.上述工作流程都不需要微流体技术(芯片、油和仪器)，且批量发生。这种形式的一个好处是可支持多步骤反应。例如，如果需要dna基因型信息，流经水凝胶的第一试剂可以是蛋白酶k，例如热敏蛋白酶k。其将消化核小体和染色质辅助蛋白，使dna可及于进一步的分子生物学。通过对细胞膜的破坏，细胞条形码寡核苷酸可以在细胞膜存在的地方结合形

成壳。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶与试剂一起流入水凝胶中，例如，可以发生通过模板导向-dna合成条码化。一旦条码化，文库制备的最后步骤可以在水凝胶内部或外部进行。

16.细胞可以在其原始培养基中与水凝胶材料混合。一旦固化，可以洗涤水凝胶以去除培养基。此外，由于每个细胞都会有一组细胞条形码克隆的寡核苷酸，所以水凝胶基质中捕捉的每个细胞会被条码化。这两个因素将细胞利用率从起始材料增加到接近100％。

17.在一些方面，提供个体细胞或个体细胞核和交联水凝胶的混合物。在一些实施方式中，个体细胞包含附接至个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。

18.在一些实施方式中，个体细胞包含锚定于个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含锚定于个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含脂质部分，其中脂质部分将异源条码化寡核苷酸锚定在细胞膜中。

19.在一些实施方式中，水凝胶被共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，水凝胶被非共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，该分子选自下组：生物素、链霉亲和素、抗体、适配体、镍(ni)、铕(eu)或包含至少6个连续核苷酸的序列的多核苷酸，其与异源条码化寡核苷酸中的序列完全互补。

20.在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，核或细胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有衔接子序列。

21.在一些实施方式中，水凝胶包括藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、胶原、纤维蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己内酯(pcl)。

22.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含细胞特异性条形码序列和3’序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如至少8个、至少10个、至少12个，例如6-30个)连续核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续核苷酸的目标基因特异性序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如，5-100个，5-25个)连续核苷酸的衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以在例如来自细胞或核的片段化dna的末端于共有衔接子序列互补。

23.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸还包含5’pcr柄(handle)序列。

24.在一些方面，提供了将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至细胞的细胞膜的异源条码化寡核苷酸的细胞或分离的细胞核或(ii)包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸的细胞核；混合该细胞或核与液态水凝胶；在该细胞或核周围交联水凝胶，其中水凝胶形成固体凝胶；从细胞膜或核膜释放异源条码化寡核苷酸以产生释放的异源条码化寡核苷酸；允许该异源条码化寡核苷酸从细胞膜或核膜释放以定位在细胞或核周围的固化的水凝胶上；将异源条码化寡核苷酸附接至细胞多核苷酸或其拷贝或其cdna上，以形成条码化细胞多核苷酸；并溶解固化水凝胶或从固化水凝胶中提取条码化细胞多核苷酸，从而从水凝胶中释放条码化细胞多核苷酸，从而将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸上。

25.在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸结合至细胞或核周围的固化的水凝胶。在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸扩散至细胞或核周围的固化的水凝胶，使得异源条码化寡核苷酸定位

在使用之前，请务必充分涡旋使磁珠保持均匀的悬浮状态。需与磁性分离设备配套使用。 UIV Chem羟基磁珠在2-8℃可稳定保存，保质期一般是2年。