甲醇/冰浴能降到多少度，乙醇/冰浴

以双链DNA测序为例，双脱氧末端终止法的基本步骤包括：变性双链模板的制备和延伸和终止反应。

1、变性双链模板的制备

① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。

② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，离心5分钟。

③ 将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。

⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。

⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

⑦ 取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠（pH 4.5）和8ml水。

⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

2、延伸和终止反应

以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

① 取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板（分别为1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。

② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。

③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。

④ 短促离心后，在37℃下保温5分钟。

⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。

⑥读取合成链的核苷酸序列。

扩展资料

延伸和终止反应中测序反应物电泳和序列读取的注意事项：

（1） 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。

（2） 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。

（3） 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。

（4） 电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。

（5） 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。

参考资料来源：百度百科-双脱氧链终止法

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

〔PCR原理〕

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

〔PCR步骤〕

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

Southern杂交

使用克隆基因作为探针，无须特殊试剂或点杂交

需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间 通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量 

仅能检测克隆的基因

仅能检测克隆的基因且无法定量 迅速，使用扩增病毒的储存液只需1天时间

可能需要优化克隆基因的PCR条件

相对快速，总共需要3天时间免疫测定

需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体 显示插入基因的蛋白表达水平

需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间 直接显示蛋白的完整性和功能 功能测定

双脱氧链终止法

是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。

其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

(二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤（以双链DNA测序为例）。

1.变性双链模板的制备

(1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmo1/L EDTA，50mmo1/L 葡萄糖)，1％ SDS，0.2mo1/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷 70％和无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。

(2) 配制方法

① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板)，离心除去上清液后，用150?l Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团，在室温下放置5分钟。

② 加入300?l的1％SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5)，颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，然后离心5分钟。

③ 将650?l上清液转移至一支新管中，加入650?l异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA，加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。

⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。

⑥ 用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50?l TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

⑦ 取0.2?g质粒DNA，并将体积调至9?l，加入1?l 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2?l 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8?l水。

⑧ 加入6?l冰冷无水乙醇，混合后在干冰／乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

水的凝固点为0℃，把干冰置于水中，由于干冰气化吸收大量的热，使其周围的水很快凝固成冰块，将块状干冰的四周和下表面包裹起来并浮出水面（干冰的比重比水大得不多，冰块会像小船一样把干冰轻易地托起），这样块状干冰只有上表面与空气接触，其余表面都与液态水隔绝，而空气和冰（固态水）都是热的不良导体，所以干冰气化速度就大大减慢。

这大概就是干冰在酒精中气化得比水中快的原因所在。

我以前做有机合成实验时，经常会大量使用干冰来控制反应温度，一般图省事都不用冰盐浴，而用干冰－酒精浴或者干冰－丙酮浴，用剩下的块状干冰不多的话，就倒入水槽中的，制造出很多“冰包干冰”，呵呵……