酵母醋酸锂转化不用鲑鱼精dna可以吗
酵母醋酸锂转化不用鲑鱼精dna可以
1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂 1M LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌必要时用消毒去离子水稀释) 50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装) 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用
(2)感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml) 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中 按50ul/管分装，立即进行转化 注：不要将感受态酵母菌冰浴
(3)毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min) 30℃水浴孵育30min 42℃水浴热休克20～25min 6000～8000rpm离心收集酵母菌体 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定
2、毕氏酵母PEG1000转化法
(1)试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 缓冲液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)，0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行)
(2)待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， -70℃保存
(3)毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀 30℃水浴孵育1h 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定
在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：
1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。如果不需要可接步骤6
4）加入10ml， pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min
5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min
6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：
第一次沉淀：250ml冰冷的水
第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇
第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇
最终的OD600应为约200
7）电转化：
在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀
9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
1、组成成分：
A、1×TE缓冲液：10 mmol/L Tris.Cl；1mmol/L EDTA，pH 8.0。
B、1×TAE缓冲液：40 mmol/L Tris-乙酸；2mmol/L EDTA，pH 8.0。
C、1×TBE缓冲液：45 mmol/L Tris-硼酸；1mmol/L EDTA，pH 8.0。
2、用途：
A、TE缓冲液：一般用作溶解剂或保持剂，常用于溶解DNA，能稳定储存DNA。
B、TAE缓冲液:生物学中使用最广泛的核酸电泳缓冲液，主要用于DNA的琼脂糖凝胶电泳。
C、TBE缓冲液：生物学中常用的核酸电泳缓冲液，主要用于DNA的琼脂糖凝胶电泳。
3、TAE和TBE缓冲液的选择：
TAE和TBE缓冲液都可以用于DNA的琼脂糖凝胶电泳，两者各有利弊，应根据实际情况选择不同的缓冲液。
TAE和TBE缓冲液的比较
TAE缓冲液:
成分：40 mmol/L Tris-乙酸；2mmol/L EDTA
优点：超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子 缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用。质量电泳大于 13kb 的片段时分离效果好，可用于回收 DNA 片段。
缺点：缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用。
TBE缓冲液：
成分：45mmol/L Tris-硼酸；1mmol/L EDTA
优点：缓冲能力强，适合较长时间电泳，分辨率较高，电泳小于 1kb 的片段时分离效果好。
缺点：缓冲液中的硼酸成分会影响 DNA 回收效率以及后续的酶反应实验。
4、注意：
TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，出现沉淀后应予以废弃。
TE缓冲液的作用及用途：对DNA的碱基有保护性，包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存。
PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质、重碳酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。
TE缓冲液的成分：
生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力差。
以上内容参考：百度百科—TE缓冲液
