磁珠包被原理
分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。
一氪生物磁珠法核酸纯化试剂
1纯化反应干扰物
干扰物有高浓度蛋白、BSA，这两种物质会导致磁珠聚沉，从而影响纯化效率，需要添加SDS处理后进行纯化。
2片段选择性能准确性干扰物
干扰物有yichun，异Bing醇，聚乙er醇，会影响片段选择回收效果，需要上调或下调磁珠使用量。
3回收片段大小限制：
大小范围为100bp-20kb，超范围片段回收效率将显著降低。
4应用范围限制：
仅用于常规分子生物学反应溶液中的DNA的纯化，磁珠不含裂解细胞及蛋白成分，不可用于组织、细胞、血浆等生物样本的DNA提取。
5原有过膜纯化方法更换为磁珠纯化方法可能带来的预期外影响
磁珠法纯化不同于过膜法纯化的原理，在替换的过程中可能预见的问题主要有：
1)磁珠法纯化中，纯化产物会存在痕量的反应液残留。
2)纯化片段大小可能发生变化
评价检测方法：
1)杂质残留影响，建议进行试用评估及测试，检测最终结果。
一般的二代测序文库构建过程中，末端修复、3‘端加A、及接头连接反应中应用磁珠法纯化，痕量残留不会对后续反应造成影响。
2)有特殊片段大小需求的情况下，可根据目标片段大小选择适宜的纯化磁珠用量。
一、按照III类医疗器械管理的产品（69个）；
二、按照II类医疗器械管理的产品（122个）；
三、按照I类医疗器械管理的产品（219个）；
四、不单独作为医疗器械管理的产品（19个）；
五、按药械组合管理的产品（22个）；
六、不作为医疗器械管理的产品（110个）；
七、视具体情况而定的产品（12个）。
说明：
1.产品分类界定结果是基于申请人提供的资料得出，不代表对其产品安全性和有效性的认可，仅作为医疗器械产品注册和备案的参考；结果中产品描述和预期用途是用于判定产品的管理属性和类别，不代表相关产品注册或备案内容的完整表述。
2. 《医疗器械分类目录》中暂无对应一级产品类别的“分类编码”以“00”表示，如“等离子体治疗仪”的分类编码：09-00。
涉及到体外诊断产品如下：
一、按照III类医疗器械管理的产品（34个）
1.即时真空自动采血仪： 由移动换管单元、刺塞混匀单元、送针单元、抽真空单元、采血管排架、光学定量检测单元、电子控制单元和溢血检测单元组成。通过机器内负压泵产生的负压对人体进行采血，依靠光学检测系统对采血量进行定量检测，采血后立即旋转采血管将血液与管内添加剂混合均匀，最终得到符合要求的血液样本。临床上用于医院门诊和采血中心采集患者静脉血使用。分类编码：22-11。
2.基因测序用文库试剂盒： 由文库扩增反应液、缓冲液、DNA连接酶和序列接头组成。用于处理从外周全血或石蜡包埋组织中提取的人类基因组DNA以及由此产生的样本库的目标序列。与Illumina二代测序仪及测序反应通用试剂盒配合使用。不用于人全基因组测序或从头测序。分类编码：6840。
3.泛素羧基末端水解酶-1（UCH-L1）测定试剂盒（磁微粒化学发光法）： 由泛素羧基末端水解酶-1（UCH-L1）检测试剂条、质控品、校准品、干燥剂组成。用于人血清样本中UCH-L1含量的测定，临床上可用于监测神经退行性疾病肿瘤发生发展过程、脑外伤的辅助诊断等。分类编码：6840。
4.阴道滴虫（T.V）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）： 由阴道滴虫（T.V）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测女性阴道分泌物、尿液样本中的阴道滴虫分泌性蛋白，临床上用于女性阴道炎滴虫感染的辅助诊断。分类编码：6840。
5.念珠球菌（C.Alb）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法： 由念珠球菌（C.Alb）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测女性阴道分泌物样品和尿液样品中的念珠球菌分泌性蛋白，临床上用于女性念珠球菌阴道炎感染的辅助诊断。分类编码：6840。
6.幽门螺旋杆菌（H.P）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）： 由幽门螺旋杆菌（H.P）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测粪便样品中的幽门螺旋杆菌分泌性蛋白，临床上用于胃炎、消化道溃疡、十二指肠溃疡等炎症的辅助诊断。分类编码：6840。
7.结核菌（TB）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）： 由结核菌（TB）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测结核菌培养基、痰液中的结核菌分泌性蛋白，临床上用于结核病的辅助诊断。分类编码：6840。
8.人外周血白细胞去除试剂盒（阴性免疫磁微粒法）： 由血液前处理液A、血液前处理液B、分离溶液和磁微粒混悬液组成。用于体外去除全血中的白细胞，以用于下游多种分析。分类编码：6840。
9.IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α测定试剂盒（流式细胞仪法）： 由捕获微球混合液、定量标准品、荧光检测试剂、校准微球、校准液A、校准液B、样品稀释液、微球缓冲液组成。用于检测血清或血浆中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白的含量。临床上用于疾病的辅助诊断、用药及预后干预。分类编码：6840。
10.IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ测定试剂盒（流式细胞仪法）： 由捕获微球混合液、定量标准品、荧光检测试剂、校准微球、校准液A、校准液B、样品稀释液、微球缓冲液组成。用于检测血清或血浆中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ蛋白的含量。临床上用于疾病的辅助诊断、用药及预后干预。分类编码：6840。
11.HER2三合一病理质控片： 由3株不同来源的经福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌细胞系样本组成。在特定的检测系统上，该质控片与HER2 DNA探针以及17号染色体探针一起使用，用于半定量监测原位杂交（ISH）的探针性能。分类编码：6840。
12.HER-2四合一病理质控片： 由4株不同来源的经福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌细胞株组成。用于监测抗-c-erbB-2/HER-2抗体的免疫组化染色性能。分类编码：6840。
13.HER2双染原位杂交三合一病理质控片： 由3株不同来源的经过福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤细胞系组成。在专用的检测系统上，与特定探针一起使用，用于临床检测实验的质量控制。分类编码：6840。
14.二硝基苯（DNP）抗体试剂： 由二硝基苯（DNP）兔单克隆抗体、含载体蛋白和防腐剂的缓冲液组成。临床上，与HER2/CEN17双探针检测试剂盒配合使用，用于检测DNP标记的HER2 DNA探针和17号染色体探针。分类编码：6840。
15.趋化因子五联检测试剂盒（流式细胞仪法）： 由捕获微球混合液（聚苯乙烯、抗人CXCL8/IL-8单抗、抗人CCL5/RANTES单抗、抗人CXCL9/MIG单抗、抗人CCL2/MCP-1单抗、抗人CXCL10/IP-10单抗）、定量标准品（人体重组蛋白冻干粉）、荧光检测试剂（PE标记的微球检测抗体）、校准微球（聚苯乙烯磁性粒子微球）、校准液A（藻红蛋白荧光素标记的对照抗体）、校准液B（异硫氰酸荧光素标记的对照抗体）、样品稀释液（缓冲液、氯化钠、胎牛血清、防腐剂）组成。与流式细胞仪配合使用，用于样本中5种趋化因子（CXCL8/IL-8、CCL5/RANTES、CXCL9/MIG、CCL2/MCP-1、CXCL10/IP-10）含量的检测。临床上用于评估机体免疫功能。分类编码：6840。
16.基因测序文库试剂盒（转座酶法）： 由试剂1（片段化缓冲液、片段化酶、扩增缓冲液、扩增酶、洗脱液）、试剂2（标签引物）、试剂3（磁珠）组成。与基因测序的通用试剂结合Illumina基因测序系统一起使用，用于处理人类基因组DNA、单细胞扩增产物、cDNA并进行文库构建。分类编码：6840。
17.基因测序用测序试剂盒： 由dNTP、反应酶、测序引物、缓冲液等组成。与基因测序用文库试剂盒、基因测序用模板试剂盒及基因测序用芯片结合Ion torrent测序平台一起使用，用于处理从组织样本中提取的人类基因组DNA以及由此产生的样本库的目标序列。不用于人全基因组或从头测序。分类编码：6840。
18.AML/MDS探针芯片（原位杂交法）： 由AML/MDS探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中P53、PML/RARA、KMT2A、AML1/ETO、5q31（EGR1/TERT）、CBFB/MYH11、7q31(D7S486/CSP7)和D20S108/CSP8基因是否存在异常。临床上用于白血病的辅助诊断。分类编码：6840。
19.ALL探针芯片（原位杂交法）： 由ALL探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中MYC、ETV6/AML1、IGH、BCR/ABL1（DF）、E2A、CDKN2A/CSP17、KMT2A、4/10基因是否存在异常。临床上用于指导酪氨酸激酶抑制剂用药。分类编码：6840。
20.MPN探针芯片（原位杂交法）： 由MPN探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中FGFR1、PDGFRB、PDGFRA、BCR/ABL1（DF）基因是否存在异常情况。临床上用于指导酪氨酸激酶抑制剂用药。分类编码：6840。
21.ph-like ALL探针芯片（原位杂交法）： 由ph-like ALL探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中CRLF2、PDGFRB、ABL1、CSF1R、BCR/ABL1（DF）、ABL2、JAK2、EPOR基因是否存在异常。临床用于Ph样急性淋巴细胞白血病的辅助诊断。分类编码：6840。
22.全自动血库系统： 由加样器、传送装置、打孔机构、孵育器、离心机、判读仪、条码扫描装置、电脑控制软件组成。临床上用于检测本公司生产的ABO、RhD血型抗原检测卡，ABO、Rh（D）血型定型检测卡，ABO、Rh血型抗原检测卡及抗人球蛋白检测卡。实现自动化样本分配、试剂分配、孵育、离心、结果判读（阴性、阳性）及储存。分类编码：22-01。
23.中性检测卡（微柱凝胶法）： 主要由8个微孔管、右旋糖苷聚体与防腐剂等组成。通过抗原、抗体反应和分子筛作用，实现凝集红细胞与未凝集红细胞的分离。临床上用于检测红细胞的凝集反应。分类编码：6840。
24.基因测序用文库试剂盒（DNA打断连接法）： 由末端修复混合液、末端修复缓冲液、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接缓冲液、PCR混合液、适用于Illumina测序平台的接头、通用引物和序列标签引物1-12组成。用于Illumina二代测序平台的DNA测序文库的构建。分类编码：6840。
25.测序用文库制备试剂盒： 主要由片段捕获反应液、引物消化酶、连接缓冲液、DNA连接酶、文库扩增反应液、扩增PCR引物、洗脱液、特异性接头混合液1-96、DNA纯化磁珠等组成。通过多重PCR技术进行目的基因扩增，再使用引物消化酶对扩增产物进行切割，形成可以连接特异接头混合液的平末端，在连接缓冲液和DNA连接酶的作用下形成可用于Ion torrent测序平台的文库。分类编码：6840。
26.表皮生长因子受体v Ⅲ（EGFR v Ⅲ）抗体试剂（免疫组织化学法）： 由表皮生长因子受体v Ⅲ（EGFR v Ⅲ）抗体、缓冲液组成。可用于体外定性检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋人体组织中的EGFR v Ⅲ蛋白，临床上用于多种肿瘤（如乳腺癌、肝癌、结肠癌）的新型诊断和治疗靶点。分类编码：6840。
27.酪氨酸激酶受体（ROS1）抗体试剂（免疫组织化学法）： 由酪氨酸激酶受体（ROS1）抗体试剂组成。临床上具有非小细胞肺癌的诊断价值或用于ROS1基因重排肺癌的筛查。分类编码：6840。
28.结核分枝杆菌分泌蛋白（Ag85B）（免疫组织化学法）： 由结核分枝杆菌分泌蛋白（Ag85B）抗体试剂组成。在常规染色基础上进行免疫组织化学染色，临床上具有结核病病理诊断价值。分类编码：6840。
29.表皮生长因子受体L858R（EGFR L858R）突变蛋白抗体试剂（免疫组织化学法）： 由表皮生长因子受体L858R突变蛋白（EGFR L858R）抗体、缓冲液组成。可用于体外定性检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋人体组织中的EGFR L858R蛋白，临床上具有非小细胞肺癌的诊断价值。分类编码：6840。
30.MDS探针芯片（原位杂交法）： 由MDS探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中5q33(CSF1R/TERT)、D20S108、5q31（EGR1/TERT）、X/Y、7q31（D7S522/CSP7）、7q31（D7S486/CSP7）基因是否存在异常。临床上用于骨髓增生异常综合征的辅助诊断。分类编码：6840。
31.IFN-γ/IL-4检测试剂（流式细胞仪法）： 由磷酸盐缓冲液（PBS）、荧光FITC/PE标记的IFN-γ/IL-4单克隆抗体组成。通过流式细胞法检测人体生物标本中IFN-γ和IL-4，临床上用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)，感染性疾病的辅助诊断。分类编码：6840。
32.文库构建与纯化试剂盒： 由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、T4连接酶缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、氯化钠脱氧核糖核苷三磷酸、去离子水、PCR引物、高保真PCR酶、羧基磁珠组成。用于Illumina二代测序文库构建以及纯化等步骤。分类编码：6840。
33.文库制备试剂盒： 由缓冲液1、反应酶1、缓冲液2、反应酶2、接头标签、PCR扩增混合液、PCR引物混合液和说明书组成。用于Illumina 测序平台的DNA测序文库的构建。分类编码：6840。
34.基因测序用文库试剂盒： 由PCR混合液、适用于Illumina测序平台的通用引物和序列标签引物1-12组成。通过一步PCR扩增，获得用于Illumina二代测序平台DNA文库构建并可根据扩增引物中的Index序列获取样本测序信息。不适用于人全基因组测序。分类编码：6840。
二、按照II类医疗器械管理的产品（22个）
1.微量元素分析仪： 由主机和软件组成。利用分光光度法，通过测量手掌上的测量点，获得皮肤内矿物质和重金属含量。用于检测人体皮肤内的矿物质和重金属含量，辅助筛查人体内重金属中毒或矿物质失衡引起的疾病。分类编码：07-00。
2.胶质纤维酸性蛋白（GFAP）测定试剂盒（磁微粒化学发光法）： 由胶质纤维酸性蛋白检测试剂条（含抗体试剂、酶标试剂、磁分离试剂、底物液、洗液）、质控品、校准品、干燥剂、说明书组成。用于体外定量检测人血清样本中胶质纤维酸性蛋白的含量。临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。分类编码：6840。
3.人14-3-3 eta蛋白测定试剂盒（光激化学发光法）： 由试剂1（抗14-3-3 eta蛋白抗体包被的发光微粒）、试剂2（生物素标记的抗14-3-3 eta蛋白抗体）、校准品（重组抗原14-3-3 eta蛋白）、低水平质控品、高水平质控品组成。用于LiCA 500系列自动光激化学发光分析系统，对人血清中14-3-3 eta蛋白进行定量测定。临床上用于类风湿关节炎的辅助诊断。分类编码：6840。
4.紫杉醇测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（紫杉醇共轭药物）、试剂2（紫杉醇抗体修饰颗粒）组成。用于定量检测人血浆样本中紫杉醇药物浓度。临床上可结合其他临床信息用于调整药物的使用剂量，提高疗效和减少不良反应。分类编码：6840。
5.伊马替尼测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液）、试剂2（伊马替尼抗体修饰颗粒）、校准品、质控品组成。用于定量检测人血浆样本中伊马替尼药物浓度。临床上结合其他临床信息用于及时调整用药剂量，提高化疗效果和减少不良反应。分类编码：6840。
6.5-氟尿嘧啶测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（5-氟尿嘧啶共轭药物）、试剂2（5-氟尿嘧啶抗体修饰颗粒）组成。用于定量检测人血浆样本中5-氟尿嘧啶药物浓度。临床上结合其他临床信息，可为医师提供剂量管理的辅助作用。分类编码：6840。
7.多西紫杉醇测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（多西紫杉醇共轭药物）、试剂2（多西紫杉醇抗体修饰颗粒）组成。用于对人血浆样本中多西紫杉醇（DTX）药物浓度的体外定量检测，临床上结合其他临床信息来进行剂量管理，提高疗效和减少不良反应。分类编码：6840。
8.可溶性CD14亚型测定试剂盒（化学发光免疫法）： 由碱性磷酸酶标记的抗可溶性CD14亚型多克隆抗体、包被了抗可溶性CD14亚型单克隆抗体的磁性粒子、化学发光底物、样本稀释缓冲液、样本洗涤缓冲液组成。用于体外定量检测人全血或血浆中可溶性CD14亚型的浓度。临床上用于脓毒症的诊断及预后评估和监测疾病的过程以及对脓毒症治疗干预措施的反应。分类编码：6840。
9.人去唾液酸糖蛋白受体H2亚基（sH2a）定量检测试剂盒（酶联免疫吸附法）： 由反应板、酶标抗体、标准品、稀释液、TMB底物溶液A、TMB底物溶液B、终止液和质控品组成。用于人血清样本中可溶形式的去唾液酸糖蛋白受体H2亚基（sH2a）的定量检测。临床上用于脂肪肝、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化等肝损伤疾病的辅助诊断。分类编码：6840。
10.抗体IgG检测专用质控： 由包被有质控抗原的质控膜条、检验对照、靶值参照表组成。用于免疫印迹法和欧蒙印迹法检测系统体外检测的质量控制。分类编码：6840。
11.兔单克隆阴性质控抗体： 由兔单克隆抗体组成。用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片内兔免疫球蛋白非特异性结合的质控。分类编码：6840。
12.细胞葡萄糖代谢检测试剂盒： 由荧光染料Ⅰ、荧光染料Ⅱ、荧光染料Ⅲ、培养基、缓冲液、裂解液组成。用于体液样本中有核细胞的培养，以区分细胞有氧糖酵解水平高低。临床上用于炎症、免疫性疾病的辅助诊断。分类编码：6840。
13.子痫前期检测试剂盒（斑点扩散法）： 主要由检测卡、染色结果示例、滴管、尿杯组成。患有子痫前期的孕妇尿液中存在错误折叠蛋白，错误折叠蛋白可与染色液特异性结合，在纤维素膜上呈现出显著的不同于正常蛋白的扩散方式。临床上通过定性检测孕妇尿液中的错误折叠蛋白来辅助诊断子痫前期。分类编码：6840。
14.帕利哌酮检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（R1：帕利哌酮共轭药物）、试剂2（R2：帕利哌酮抗体修饰颗粒 ）、校准品、质控品组成。临床上通过测定人血清样本中帕利哌酮的浓度控制患者的用药剂量。分类编码：6840。
15.利培酮检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）： 由试剂1（R1：利培酮共轭药物）、试剂2（R2：利培酮抗体修饰颗粒）、校准品、质控品组成。临床上通过测定人血浆样本中利培酮浓度控制患者的用药剂量。分类编码：6840。
16.伊马替尼血药浓度测定试剂盒（液相色谱-串联质谱法）： 由校准品、质控品、内标等组成。通过液相色谱-串联质谱法，体外定量检测人指尖外周血采集卡干血斑中伊马替尼的浓度，临床上为医生控制患者用药剂量提供参考。分类编码：6840。
17.尿酸代谢物检测试剂盒(比色法)： 由缓冲液、酶物、针探（显色液）、标准物质组成。通过对人体尿液的检测定性检测人体尿酸(次黄嘌呤,黄嘌呤)衍生物代谢是否正常，临床上用于代谢综合征的辅助诊断。分类编码：6840。
18.嗜酸性粒细胞阳离子蛋白酶标特异性抗体： 主要由ß-半乳糖苷酶-抗IgE (小鼠单克隆抗体)、叠氮化钠组成。与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白检测试剂（荧光免疫法）配套使用，临床上通过体外定量检测人血清中的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，用于辅助诊断嗜酸性粒细胞介导的炎症性疾病，如哮喘。分类编码：6840。
19.胰弹性蛋白酶1（E1）检测试剂盒（酶联免疫法）： 由酶标板、样本/洗涤缓冲液、标准液1-4、对照液1、对照液2、生物素-抗生蛋白链菌素-过氧化物酶（POD）标记的抗E1单克隆抗体、底物液、终止液组成。通过酶联免疫方法定量测定人粪便样本中E1。临床上用于诊断或排除与胃肠病状相关的胰腺疾病。分类编码：6840。
20.胍基乙酸和肌酸测定试剂盒（串联质谱法）： 由内标品、高水平质控品、低水平质控品、质控品质量分析报告、内标品质量分析报告组成。通过串联质谱（MS/MS）技术，测定滤纸干血片中胍基乙酸（guanidineacetic acid，GAA）和肌酸（creatine，CRE）的浓度，适用于0-15岁（包括新生儿）及大于15岁人群的胍基乙酸和肌酸水平异常检测，临床上用于胍基乙酸甲基转移酶缺陷的辅助诊断。分类编码：6840。
21.葡萄糖校准液： 由葡萄糖、杀菌剂、稳定剂、磷酸盐稀释剂组成。配合葡萄糖检测仪使用，主要用于生物传感器类葡萄糖检测仪的校准。分类编码：6840。
22.精子染色质结构检测试剂盒： 由A试剂（盐酸、Tween-20、PBS）、B试剂（吖啶橙、水）组成。用于人体精子染色质的染色，判断染色质DNA断裂水平和计算发生DNA断裂的精子比例，同时还可通过染色质与蛋白结合的程度分析未成熟精子的比例。分类编码：6840。
一、磁珠吸附DNA和片段筛选原理
一般磁珠由三层构成，最里面是聚苯乙烯，外面包裹一层磁性物质四氧化三铁，最外面再包一层高分子材料，上面偶联不同的官能团。不同功能的磁珠，偶联的官能团不同，纯化核酸用的一般是羧基（-COOH）。
磁珠纯化DNA/RNA核心技术是固相可逆固定化技术（Solid-phase reversible immobilization，SPRI），但磁珠和DNA具体是如果相互作用吸附在一起，目前还不是很清楚，盐桥理论是其中猜想之一。在较高浓度的PEG和NaCl溶液中，PEG夺取DNA分子外面水化层的水，导致水化层被破坏，DNA分子发生聚集沉淀，带负电的磷酸基团裸露出来，通过钠离子与磁珠表面的羧基形成“盐桥”，或者也叫“电桥”，使得DNA吸附到磁珠表面。
DNA越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收；DNA越短，就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而回收回来。所以如果想回收较短的DNA片段时，需要加入的磁珠体积更大。
此外，体系中的PEG还可以增加溶液的粘稠度，让磁珠保持悬浮不容易沉聚，在DNA binding过程中更充分与DNA接触，同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用，其储存buffer里也会加一些低浓度的pH稳定剂，如Tris-HCl等。
二、酒精清洗盐离子
DNA吸附上磁珠之后，会用75—85%的酒精去清洗体系中残留的盐，盐被洗掉了，盐桥被破坏，DNA不就从磁珠上掉下来了吗？其实不是这样的，第一，DNA在这个浓度的酒精里溶解度很低；第二，DNA这个时候是聚集状态，磁珠刚好提供一个聚集的奇点，让DNA沉聚在其周围，所以绝大部分DNA不会掉下来。但酒精浓度很重要，一般都要求新鲜配制，浓度太低，体系中过多的水会将部分DNA从磁珠上溶解下来，造成DNA损失。具体使用多少浓度的酒精视情况而定，浓度越高，体系中水越少，清洗盐离子的能力减弱，但DNA的溶解度小，回收率高；酒精浓度越低，盐离子可以清洗得更干净，但DNA的回收率可能会收到影响。如果DNA片段较小（小于100bp），清洗推荐使用较高浓度的酒精，减少清洗时的损失，甚至可以在结合磁珠的时候就加入一定量的酒精，辅助DNA沉淀，以提高回收率。
三、洗脱DNA
酒精清理后，先需要晾干磁珠上残留的酒精，以防影响下游实验。晾干后加入水或者TE buffer，这时体系中已经没有钠离子和PEG，无法形成电桥结构，带负电的DNA和磁珠之间相排斥，水重新包裹DNA形成水化层，使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中。注意晾干时磁珠表面无光泽即可，过度干燥，体系失水过多，会导致磁珠DNA进一步聚集，最终DNA很难回溶到水中，影响回收率。
四、磁珠和柱子
柱子回收DNA原理和磁珠差不多，不同的是大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后也带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA。目前除了少数磁珠表面也还是采用硅羟基，主流磁珠，比如Ampure XP beads，基本上都换成产量更高，非特异性结合更少的羧基化磁珠。
五、磁珠与RNA
不管双链DNA、单链DNA，还是RNA，都可以在溶液中解离出带负电的磷酸基团，因此都可以用磁珠进行纯化回收，但单链DNA和RNA都没办法进行片段大小筛选。双链DNA的二级结果一般是一条较稳定的线性双螺旋分子，在PEG的存在下，解离出来带负电的磷酸基团多少和其长度正相关，而RNA和单链DNA，二级结构比较复杂，导致其裸露出来的负电基团无法跟长度呈正相关，所以没办法像DNA那样进行片段筛选。
另外RNA和DNA在不同pH下稳定性不一样，所以纯化RNA的磁珠buffer中pH和纯化DNA的磁珠是不一样的。
资料参考：
John T. Lis，Robert Schleif. Size fractionstion of double stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acid Research(1975)
L. S. Lerman. A transition to a compact form of DNA in polymer solution. PNAS(1971)
Spin column based nucleic acid purification, https://en.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification
羟基磁珠表面修饰大量的硅烷醇集团(羟基),能在高盐低pH条件下和溶液中的核酸通过疏水作用、氢键作用和静电作用等发生特异性结合,而不与其他杂质(如蛋白)结合
2 外泌体的提取纯化方法
2.1 基于密度的分离方法
2.1.1 超速离心法
超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡
2.1.2 蔗糖密度梯度离心法
目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡
2.2 沉淀法
2.2.1 聚乙二醇 (PEG)
PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡
2.2.2 试剂盒法
最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡
2.3 基于大小的分离方法
2.3.1 SEC SEC
主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡
2.3.2超滤法
超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡
2.4 基于表面成分亲和力的分离法
2.4.1 蛋白质
外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡
2.4.2 膜磷脂
虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡
2.5 ACE分离法
ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡
2.6 微流控芯片法
微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡
提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。
admin 2022-06-16 06:16:13 8次
该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
用于单细胞测序的细胞条码化
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年11月4日提交的，题为“用于单细胞测序的细胞条码化”的第62/930,288号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用纳入本文，用于所有目的。
3.发明背景
4.目前的液滴微流体方法实现了数千细胞的通量。然而，更大的数量可能难以实现。使用微流体技术，至少有三个导致细胞悬浮液死体积和因此用于分析的细胞丢失的因素：1)微流体装置的入口处的剩余液体2)微流体通道预划分中的剩余液体和3)未从微流体装置的出口处收集的材料。此外，非常大的液滴乳化体积，对应于高细胞通量实验，很难以及时的方式产生，由于所需的体积。这可能对于细胞活力和细胞内含有的不稳定的核酸底物(如rna)有不利影响。最后，当产生较大的液滴乳液时，其增加的体积使其难以将单个乳液装载入与热循环仪兼容的单管中，从而进一步限制了大乳液体积的实施。
5.单细胞条码化平台需要昂贵的微流体技术(芯片、油和仪器)和条形码珠。仪器还需要昂贵的现场服务工程师来维护和解决硬件问题。
6.虽然液滴微流体技术改进了可扩展性，除非使用更复杂的芯片上(on-chip)液滴合并和皮注射(picoinjection)功能，否则只支持添加一种溶液。
7.用寡核苷酸直接标记细胞是使用寡聚物-偶联珠的选择。然而，在不破坏细胞生理的情况下，装载到细胞上的寡核苷酸的最大数量约为100-1000万。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的终浓度往往将不足以驱动分子生物学反应，因此阻止液滴与直接寡核苷酸标记的细胞兼容。
8.发明概述
9.高密度寡核苷酸，范围达到106至107个分子，可以通过各种方法附接至细胞。例如，可以通过细胞特异性寡核苷酸偶联抗体(stoeckius等2018，genome biology)或通过脂质修饰的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)标记细胞。寡核苷酸细胞附接创造了直接在细胞上构建细胞条形码的可能性，例如，通过拆分汇集条形码构建(fan等2015，science)。这些细胞条形码反过来可以用于条码化靶向的细胞的核酸底物。
10.以前，这种形式的细胞条码化的一个要求是，在寡核苷酸裂解或从细胞释放之前，细胞与附接细胞条形码寡核苷酸的互补物必须被共同限制在分区中，此时可以发生与细胞核酸底物的附接。虽然液滴提供划分格式用于这种类型的反应，但是存在一些缺点。首先，单个乳液中液滴的数量上限是约100-200万。为了尽量减少多个细胞共同定位于单个液滴中，可以以大约0.05-0.1的λ装载细胞。基于每个乳液的液滴数量，封装的细胞的数量被限制在最大50,000至100,000。这种细胞通量对于某些类型的实验可能是不足够的，且受到向上可扩展性的限制。第二，由于入口处、微流体和液滴中剩余的细胞悬浮液不能从出口处收获，使用液滴微流体技术的细胞损失很难消除，导致细胞利用率为约60-85％。对于珍贵的细胞，这种水平的细胞利用率可能是不足够的。第三，液滴微流体技术需要芯片、油和仪器，都昂贵且难以支持。第四，在已经形成的液滴中加入试剂并在保持液滴的同时洗涤产物，虽然通过皮注射、液滴合并和磁珠捕获方法是可行的，但不容易工程化。这种限制使得单细胞
dna分析困难，因为简单的液滴微流体技术不支持蛋白酶k消化、随后失活然后加入生物化学品。第五，因为只有100-1000万寡核苷酸可以在不破坏膜的情况下被装载到细胞上，液滴必须有几十pl的体积，以提供足够的寡聚物浓度以驱动分子生物学反应。这些小液滴可能很难通过两个水性入口的微流体技术实现。第六，在进行条码化反应之前，细胞通常必须被清洗以除去其培养基。这明显增加了细胞损失。
11.本方法用液滴解决了上述限制，如下：在细胞上建立细胞条形码后，用与细胞密度匹配的水凝胶溶液重悬细胞，使得细胞不沉降。这可以通过用于保持细胞悬浮的常用试剂实现，例如蔗糖缓冲、percoll(西格玛(sigma))和/或optiprep(西格玛)。然后接着发生水凝胶的固化(solidification)。固化背后的机制取决于用于水凝胶的材料。例如，琼脂糖的固化会由温度下降引起。或者，藻酸盐可以使用钙交联。或者，temed启动了聚丙烯酰胺单体的交联。因此，细胞被分散在整个固化的水凝胶基质中。
12.水凝胶可以经或不经修饰以结合细胞条形码寡核苷酸。例如，细胞条形码寡核苷酸可以在5’端用生物素修饰，亲和素类似物(例如链霉亲和素)可以被偶联至水凝胶材料。因此，当在溶液中时，带有结合的寡核苷酸的细胞将自由移动，然而，一旦水凝胶固化，任何释放的寡核苷酸将在细胞膜的直接的附近结合至基质，在细胞膜存在的地方形成壳或皮。例如，0.01至10％重量/体积(wt/vol)的水凝胶对离子和非离子去污剂、以及低分子量蛋白质、酶和辅因子是多孔的。因此，在将细胞捕获在水凝胶基质中之后，细胞裂解剂(例如0.1％np-40)可以被应用于细胞。裂解剂将通过基质扩散并裂解细胞。细胞条形码寡核苷酸裂解或释放将作为细胞裂解和膜溶解的直接结果发生，或通过特异性或非特异性试剂从细胞裂解或释放寡核苷酸。然后释放的细胞底物核酸将结合至细胞条形码寡核苷酸，其已经被固定在细胞膜/水凝胶界面的壳中。
13.通过细胞/水凝胶界面圈起来的区域的体积基本上是细胞的体积。无论细胞条形码寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的壳上，这种最小体积将显著增加细胞条形码寡核苷酸的有效浓度，达到最大值。这可以补偿，例如，对于在不影响细胞生理的情况下可以被装载到细胞上的细胞条形码寡核苷酸数量有限，例如，每个细胞100-1000万寡核苷酸。对于直径约为9微米的细胞，用200万寡核苷酸的有效浓度将是几百个nm，其为足以支持大多数分子生物学反应(例如逆转录)的浓度。低分子量rna或dna依赖性聚合酶可以与裂解剂一起或之后加入，也可以在中间的洗涤之后加入，以除去或灭活细胞裂解剂。
14.一旦细胞底物核酸加细胞条形码寡核苷酸标签，导致细胞条码化发生，在从固化或未固化的水凝胶基质除去材料之后，文库制备的最后步骤可以在水凝胶基质中或溶液中发生。例如，逆转录酶，由于其低分子量，将流经组合物中高达5％的水凝胶。将其与裂解剂一起，或是与或不与寡核苷酸裂解/释放剂一起应用，将导致以下事件。随着裂解剂溶解细胞膜，细胞条形码寡核苷酸将结合至水凝胶以在细胞膜存在的位置形成壳。释放的rna将结合至在细胞膜存在的壳上固定的寡核苷酸，逆转录酶将合成cdna。这就是条码化反应。一旦发生，水凝胶可以被溶解，制备ngs文库的最终步骤就可以批量完成。
15.上述工作流程都不需要微流体技术(芯片、油和仪器)，且批量发生。这种形式的一个好处是可支持多步骤反应。例如，如果需要dna基因型信息，流经水凝胶的第一试剂可以是蛋白酶k，例如热敏蛋白酶k。其将消化核小体和染色质辅助蛋白，使dna可及于进一步的分子生物学。通过对细胞膜的破坏，细胞条形码寡核苷酸可以在细胞膜存在的地方结合形
成壳。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶与试剂一起流入水凝胶中，例如，可以发生通过模板导向-dna合成条码化。一旦条码化，文库制备的最后步骤可以在水凝胶内部或外部进行。
16.细胞可以在其原始培养基中与水凝胶材料混合。一旦固化，可以洗涤水凝胶以去除培养基。此外，由于每个细胞都会有一组细胞条形码克隆的寡核苷酸，所以水凝胶基质中捕捉的每个细胞会被条码化。这两个因素将细胞利用率从起始材料增加到接近100％。
17.在一些方面，提供个体细胞或个体细胞核和交联水凝胶的混合物。在一些实施方式中，个体细胞包含附接至个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。
18.在一些实施方式中，个体细胞包含锚定于个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含锚定于个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含脂质部分，其中脂质部分将异源条码化寡核苷酸锚定在细胞膜中。
19.在一些实施方式中，水凝胶被共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，水凝胶被非共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，该分子选自下组：生物素、链霉亲和素、抗体、适配体、镍(ni)、铕(eu)或包含至少6个连续核苷酸的序列的多核苷酸，其与异源条码化寡核苷酸中的序列完全互补。
20.在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，核或细胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有衔接子序列。
21.在一些实施方式中，水凝胶包括藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、胶原、纤维蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己内酯(pcl)。
22.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含细胞特异性条形码序列和3’序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如至少8个、至少10个、至少12个，例如6-30个)连续核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续核苷酸的目标基因特异性序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如，5-100个，5-25个)连续核苷酸的衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以在例如来自细胞或核的片段化dna的末端于共有衔接子序列互补。
23.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸还包含5’pcr柄(handle)序列。
24.在一些方面，提供了将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至细胞的细胞膜的异源条码化寡核苷酸的细胞或分离的细胞核或(ii)包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸的细胞核；混合该细胞或核与液态水凝胶；在该细胞或核周围交联水凝胶，其中水凝胶形成固体凝胶；从细胞膜或核膜释放异源条码化寡核苷酸以产生释放的异源条码化寡核苷酸；允许该异源条码化寡核苷酸从细胞膜或核膜释放以定位在细胞或核周围的固化的水凝胶上；将异源条码化寡核苷酸附接至细胞多核苷酸或其拷贝或其cdna上，以形成条码化细胞多核苷酸；并溶解固化水凝胶或从固化水凝胶中提取条码化细胞多核苷酸，从而从水凝胶中释放条码化细胞多核苷酸，从而将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸上。
25.在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸结合至细胞或核周围的固化的水凝胶。在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸扩散至细胞或核周围的固化的水凝胶，使得异源条码化寡核苷酸定位
个人感觉应该不会是磁珠，毕竟通过离心或者磁铁吸引的方式可以很轻松的分离磁珠，而且机制来说也说不清楚。
建议你补两个实验，一个是菌液、菌液+磁珠（这个是在体系里面直接加菌液，再加入磁珠，然后pcr）直接做PCR，看看结果如何。另一个是把结合菌液磁珠接种，然后培养。根据这两个结果应该就能判断问题。
磁珠法提取核酸的原理是依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。
磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。
利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
磁珠法核酸提取，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：
①能够实现自动化、大批量操作，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病爆发时能够进行快速及时的应对，这一特点使得传统方法望尘莫及；
②操作简单、用时短，整个提取流程只有四步，大多可以在36-40分钟内完成；
③安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害减少到最少，完全符合现代环保理念；
④磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。
磁性微球从诞生开始，它就受到了科研工作者的关注，并且在生化分析领域得到成功的应用。近年来，将磁性微球包被上特异性抗体、受体、单链DNA，用于分离复杂样品中的靶体，取得巨大成功。与传统的分离方法相比，把磁性微球用于复杂组分的生化样品的分离，能够实现分离和富集同时进行，大大提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提高。目前，这种磁性微球已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。最近，已经有相关的文章报道了将磁性微球应用于检测环境样品中的痕量微生物或者某些活性化学物质，取得了很好的效果。
一般地，用于生化分析的磁性微球必须满足以下条件：
1) 超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象；
2) 合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；
3) 具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
超顺磁性微球可以用于以下几个方向：
Ø
细胞分选
Ø
蛋白质纯化
Ø
核酸提取
Ø
细菌检测
Ø
免疫沉淀反应
Ø
免疫层析检验
Ø
生物传感器
Ø
生物芯片
上海奥润微纳新材料科技有限公司专注于开发磁性纳米材料及其生物医学应用技术与产品，拥有多项自主开发的专利技术，产品包括系列化磁性纳米微球、磁性纳米颗粒、生物应用试剂盒及配套仪器装备等，为核酸、蛋白和细胞分离纯化，细胞及生物分子的标记，基因转染，疾病的快速与早期诊断及磁共振影像诊断等领域提供了新型、高效、快捷的工具和解决方案。
奥磁®超顺磁性纳米微球简介
奥磁®超顺磁性拿米微球是采用本公司独特的专利技术生产的全新磁珠产品，是目前国际上唯一同时具备高磁含量（大于70%）组装磁核、单分散性可控粒径、均匀核壳结构、高比表面积特色的，直径介于纳米和亚微米之间的新型磁性微球。它既避免了传统大直径微球磁含量低、比表面积小的缺点，又克服了小直径微球磁响应速度慢的不足，良好的粒径特性保证了表面物理化学性质的一致，为获得高质量、可靠的生物分离、纯化与检测结果提供了保障。
目前本公司已形成奥磁®超顺磁性氧化硅纳米微球和奥磁®超顺磁性聚合物纳米微球两大系列产品。
超顺磁性氧化硅纳米微球专为核酸纯化设计而成，此种微球具有核壳结构，即高磁性核心及无机氧化硅外壳，表面附着大量硅烷醇基团，悬浮于水中。在特定的溶液环境中，纳米微球能够将核酸从待分离材料中迅速分离出来。可应用于各种核酸纯化，如血液中染色体DNA、细菌染色体DNA、病毒的DNA/RNA、PCR片段、质粒DNA提取。磁珠法提纯核酸不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是核酸纯化方法发展的一个重要方向。
优点
²
微球平均粒径小，比表面积大；
²
磁含量高，磁响应速度快；
²
每毫克磁性微球DNA/RNA结合能力高达12μg；
²
优异的胶质稳定性；
²
重分散性好。
超顺磁性聚合物纳米微球，具有单分散性、粒径分布均一、胶体稳定性高、超顺磁响应等特点。在微球表面修饰上一系列不同的化学官能团，可与蛋白、配基结合，应用于蛋白纯化、亲和层析、细胞分类筛选、免疫测定分析、临床诊断等多个生物领域，是医学、分子生物学研究中不可或缺的分离纯化工具之一。
优点
²
微球粒径小，比表面积大；
²
磁含量高，磁响应速度快；
²
结合能力高；
²
优异的胶质稳定性；
²
重分散性好；
²
功能化微球表面，适合偶联多种生物探针；
²
从复杂材料中快速分离出目的产物，并保持其生物活性。
