1丁烯的微生物降解途径

微生物采油对低产、枯竭油田特别有吸引力，能提高采收率。

4

、不污染环境

微生物采油技术不污染环境，不损害油地层，可在同一油藏区或同一油井中反复使用。

（三）采油微生物的生物学特性

用于油田开采的微生物一般具有以下鲜明的生物学特征：

1

、厌氧或兼性厌氧。在地层无氧条件下能生长繁殖并进行厌氧发酵，在地上有氧条件下也

能生长繁殖。

2

、在油层高温、高压、高盐等极端环境下能生长繁殖并代谢。

3

、多数采油微生物能以烃类作碳源，能以贮油层

内的无机盐作氮源或作营养元素。

4

、采油微生物必须与其注入油层的环境条件相配伍相适应，要在油层内能运移，能生长繁

殖，能产生有机酸、气体、表面活性物质、生物聚合物、有机溶剂等多种代谢产物。能在

50°

以上的温度及缺氧条件下生长的中度嗜盐细菌，是微生物采油中最常用的菌种。

（四）微生物采油技术

微生物采油技术是指将筛选的微生物或微生物代谢产物注入油藏，

经微生物的代谢活动

和产生的代谢产物，

作用于原油，

改变原油的某些物理化学特性，

从而提高原油采收率的技

术。

根据实施过程与方法的不同，

微生物采油技术可分为地上微生物采油技术和地下微生物

采油技术。

1

、地上微生物采油技术

地上微生物采油技术是指在地上通过微生物发酵、生产微生物的某种代谢产物，如生物

多糖聚合物或生物表面活性剂，

然后将发酵产品注入油藏而提高原油采收率。

该技术的实质

是利用选育的优

良菌种在地上发酵生产采油制剂的技术。

目前，地上微生物采油技术主要是在地上发酵生产采油中广泛应用微生物多糖和微生物

表面活性剂。

（

1

）微生物多糖

据研究，

有百种以上的微生物能产生结构、

性能各异的胞外多糖。

能产胞外多糖的主要

微生物类群是：明串珠菌属、黄单胞菌属、固氮菌属和小核菌属等。

采油工业中应用最广泛的微生物多糖是：

肠膜明串珠菌或葡聚糖明串珠菌产生的右旋糖

酐葡聚糖、

普鲁兰出芽短梗霉产生的普鲁兰糖、

齐整小核菌或葡聚糖小核菌产生的小核菌葡

聚糖。采油中最具开发应用潜力的是野油菜黄单胞菌产生的胞外多糖黄原胶。

（

2

）微生物表面活性剂与乳化剂

以烃为碳源的微生物是生物表面活性剂的重要来源。

因为石油微生物必须分泌表面活性

剂，才能促使烃与水乳化。烃只有均匀地分散在水中，才能被石油微生物吸收利用。所以石

油微生物是表面活性剂最丰富的基因库。

假单胞菌属、节杆菌属、不动杆菌属和棒杆菌属等是产生生物表面活性剂

的主要微生

物类群。微生物产生的生物表面活性剂就其化学组成来分，主要可分为糖脂类和脂肽类

。

分子的极性端或是多羟基的糖类或是氨基酸类，

非极性端是长链脂肪酸的长链烃部分。

微生

物表面活性剂的粗制品或纯品注入贮油岩层，

作用于油一岩石一水三相体系，

降低油水界面

张力，增强油水乳化，提高原油采收率。

2

、地下微生物采油技术

地下微生物采油（

MEOR

）技术是指将在地上模拟油藏条件筛选的微生物菌种与营养物

注入油藏，

微生物在油藏中运移，生长繁殖，

产生多种代谢产物，

作用于原油而提高原油采

收率；

或用生长繁殖的菌体细胞及代谢产物封堵贮油岩层大的孔道，

调整水驱油剖面；

或只

将营养物注入油藏，激活油藏内的原生微生物，靠其生命活动提高原油采收率。

根据单井增产措施的处理方法和提高原油采油率的要求，地下微生物采油可分为

6

类：

（

1

）单井周期注人微生物采油

为提高低产油井的原油日产量，

在油井高压注入采油微生物，

关井，

使微生物运移到油

井周围直径

10m

左右的贮油岩层，经微生物的生命活动，疏通被堵塞的油层空隙通道，增

加原油的流动性，提高原油采收率。

为了保持高产，需要不间断地、周期性地注入采油微生

物。

（

2

）微生物驱油

采油微生物从注水井注入油层，

微生物随注水向油井贮油层深部移动，

同时进行生长繁

殖，并产生多种代谢产物。细胞和代谢产物综合作用于原油，降低黏度，增加原油流动性，

提高原油采收率。

（

3

）激活油藏微生物群落驱油

油藏中存在着天然的微生物群落，

但由于营养物质贫乏，

数量很少。

从注水井将营养物

注入油层，激活天然微生物群落，让其生长繁殖，产生多种代谢产物驱油。

（

4

）微生物选择性封堵

将体形较大且产生表面黏稠物质的微生物菌种从注水井注入，

运移到大孔道或有溶洞的

贮油岩层部位，用生长繁殖的大菌体细胞和表面黏稠物质形成的生物膜封堵大孔道或溶洞，

防止注入水

“

指状

”

流动，提高原油采收率。

（

5

）微生物压裂液压裂

将厌氧条件下大量产生有机酸的微生物及营养物注入空隙度甚小、渗透率很低的贮油

层，在高压下用有机酸溶解岩层使之形成缝隙，有利于原油流动，提高原油采收率。

（

6

）微生物油井清蜡

原油中含蜡量较高，

会析出蜡晶固着在井壁，

堵塞贮油层通往井壁的空隙通道，

降低原

油流动性，

减少单井原油日产量。

注入产生表面活性剂或溶剂的采油微生物，

用其代谢产物

表面活性剂、乳化剂清洗井壁，溶解固形石蜡，提高原油采收率。

（五）微生物在石油污染中的生物修复作用

1

降解石油的微生物种类及分布

据目前的研究

,

能降解石油的微生物有

70

个属

,

其中

28

个属细菌

, 30

个属丝状真菌

, 12

个属酵母

,

共

200

多种微生物。海洋中最主要的降解细菌有：无色杆菌属

(Achromobacter)

、

不

动

杆

菌

属

(Acinetobacter)

、

产

碱

杆

菌

属

(Alcaligenes)

等

真

菌

中

有

金

色

担

子

菌

属

(Aureobasidium)

、假丝酵母属

(Candida)

等。石油降解菌通常生长在油水界面上

,

而不是油液

中。据丁美丽等

[5]

在胶州湾的实验证明

,

胶州湾的石油降解菌在表层水体中的最高值可达

4.6×

102

个

/mL

。

石油降解菌数量仅与海水的石油污染情况有关。

石油降解微生物的种类和

数量对海洋中石油的降解有明显的影响。

一般情况下

,

混合培养的微生物对石油的降解比纯

培养的微生物快

,

但是崔俊华等在实验中筛选出了

7

株高效原油降解菌。

2

石油降解菌的作用

（

1

）作为油污染的生物指示

以往大多数调查结果表明

,

在海洋中石油烃降解细菌的数量或种群与水域受到油类物

质污染的程度有密切关系

,

通常在被油污染的水域中

,

石油烃降解细菌的数量明显地高于非

油污染的水域。

烃类降解菌数和异养细菌数的比值能在一定程度上反映水域受油污染的状

况。

丁美丽等在胶州湾的工作以及史君贤等在浙江省海岛海域的工作都证明了这一点。石

油污染可以诱导石油降解菌的增殖及生长

,

Atlas

报道在正常环境下降解菌一般只占微生物

群落的

1%,

而当环境受到石油污染时

,

降解菌比例可提高到

10%

。说明石油污染可以使降

解菌发生富集

,

降解菌可以作为石油污染的生物指示。

（

2

）通过自身代谢作用降解石油

向水体中投加菌种净化水体的技术是从清除海洋石油污染开始的。

实验室研究表明

,

单

一菌剂除油率为

20%

～

50%,

而混合菌剂除油率可达

71.4%

。

丁明宇等

[8]

从青岛近海海水中

分离、

筛选到

73

株细菌和

10

株真菌

,

并对其降解石油的能力进行了研究

,

结果表明

,

多

数菌具有明显的降解石油的能力

,

其中

,

有

3

个菌株对石油的生物降解率分别高达

58.35%

、

62.75%

、

71.06%

。史君贤等

[9]

在浙江沿海海水中分离石油烃降解细菌

,

并实验

证明降解菌对正烷烃有明显的降解作用

,

混合菌株的降解率明显高于单菌株的降解率。在

20

℃的条件下

,

经过

21d

后

,

绝大部分的正烷烃被降解

,

总的降解率为

94.93%,

其中细菌

的降解率为

75.67%,

理化降解率为

19.26%

。在实施接种的现场生物修复处理中

, 1990

年在

墨西哥湾和

1991

年在得克萨斯海岸都获得了成功

,

现场观察表明

,

在开放水体中添加降解

菌是有效的。

（

3

）合成生物表面活性剂

,

加速石油的降解

生物表面活性剂

(Biosurfactants,

简称

BS)

是细菌、

真菌和酵母在某一特定条件下

(

如合

适的碳源、

氮源、

有机营养物、

pH

值以及温度

) ,

在其生长过程中分泌出的具有表面活

性的代谢产物。

生物表面活性剂可以强化生物修复

,

它能将烃类物质乳化

,

进而促进其降解

,

尤其适合处理海上溢油。

Chabrabarty

曾报道

,

由

Pscndomona

acruginosa

(

铜绿假单胞菌

)

生成的一种生物表面活性剂

(

海藻糖酯

)

由于能有效地将石油分散成水液滴

,

因而可促进石油

污染海岸的生物修复

,

大大提高了

Exxon

Valdez

原油泄漏造成的阿拉斯加污染区域石油烃

的降解速度。

（

4

）基因工程菌

基因工程菌是将不同细菌的降解基因进行重组

,

将分属于不同细菌个体中的污染物代

谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌

,

可以有效地提高微生物的降解能

力

,

从而提高生物修复效果。

通常石油降解菌只能降解某一种石油成分

,

并且由于石油的种类不同

,

所需降解菌也不

相同

,

天然环境中存在的石油降解菌不能高效地降解多种石油成分

,

使基因工程菌的出现成

为必然。同时

,

复杂的烃类化合物混合物的降解需要有混合菌株的参与

,

但不同菌株之间可

能会产生竞争或拮抗作用

,

从而对降解产生负面影响。使用基因工程菌可以避免此类问题。

目前

,

已有人在实验室条件下获得基因工程菌并在实验室取得满意的降解效果。

例如美

国的

Chakrabaty

等使用具有

CAM

、

OCT

、

XAL

和

NAH4

种降解质粒的

“

多质粒超级

菌

”

,

可以使海上浮油在几个小时内降解

,

而在自然条件下这些浮油需要

1a

时间才能被降

解。这项技术取得了美国的专利权。但是考虑到在开放环境中使用基因工程菌的安全问题

,

目前基因工程菌的使用仅限于实验室

,

尚不能大规模使用。

另外

,

目前在研制基因工程菌时

,

都采用给细胞增加某些遗传缺陷的方法或是使用携带一段

“

自杀基因

”

,

使该工程菌。在非

指定底物或非指定环境中不易生存或发生降解作用。

3

微生物降解石油的方式

石油烃化合物可分为

4

类

:

饱和烃、

芳香族烃类化合物、树脂及沥青质。其中

,

短链

的饱和烃在溢油发生初期通过挥发等作用进入大气

,

其他的石油烃中

,

饱和正烷烃最易降解

,

其次是分支烷烃

,

再次是低分子量芳香烃

,

多环芳烃很难降解

,

树脂和沥青质极难被降解。

直链烷烃的降解方式主要有

3

种

:

末端氧化、

亚末端氧化和氧化。

芳香烃在好氧条件

下先被转化为儿茶酚或其衍生物

,

然后再进一步被降解。

高分子量多环芳烃降解菌报道很少

,

许多四环或多环高分子量多环芳烃的降解是以共代谢

(Cometabolism)

的方式进行的。但是共

代谢完全是间接或偶然的事件

,

并且风险较大

,

可能会产生比母体毒性更大的化学物质。

树

脂和沥青质极难被降解

,

但是有报道称

,

有着复杂构造的树脂和沥青质也能受到某种程度的

分解

[14]

。

冷凯良等的实验表明

,

微生物降解原油代谢产物主要是乙酸和棕榈酸为主的脂肪酸与

鼠李糖形成的糖脂类表面活性剂。

4

石油降解菌的获得

由于天然海洋环境中石油降解菌数量较少

,

一旦发生溢油

,

不能及时对石油进行降解

,

所以

在溢油发生后一般要向环境中添加石油降解菌以保证石油的高效降解

,

但是考虑到安全等

方面的问题

,

菌种不能盲目投加。

一般来说

,

可以把取自自然界的微生物

,

经人工培养后再

投入到污染环境中去治理污染。

具体到海洋石油降解菌的获得

,

一般为

:

首先选择油污染环

境

,

从中分离出适应性菌株

,

并将其中的石油降解菌富集培养

,

通过反复适应和驯化或遗传

修饰进行进一步筛选

,

从而培养出高效降解的菌株

,

将其进一步繁殖后投加至受污染环境中

或分类保存。

根据微生物与石油的作用机制

,

选择高效降解微生物的标准包括：

( 1)

对石油有较高的耐性。

( 2)

对海洋环境的适应性较强。

( 3)

对石油的降解效率高

,

专一性强。

( 4)

不影响海洋环境中原有的生物多样性。

虽然微生物修复主要是依靠微生物的降解能力降解污染物

,

但是微生物对污染物的分

解、转化也是需要条件的

,

所以除了投加高效降解菌之外

,

还要为这些降解菌创造必要的生

存、

降解条件。这样才能有效地进行石油污染修复。

5

影响微生物降解石油污染物的因素

微生物在降解石油污染物的过程会受到营养元素、表面活性剂、

O

2

通量、温度、

pH

值

等外界因素的影响。其中

,

营养元素对降解率的影响较大，尤其是

N

、

P

元素。

何良菊等专门

对石油烃微生物降解的营养平衡进行了研究，

表明氮、

磷营养物质的缺乏直接限制了石油烃

的微生物降解

,

但添加过量反而有抑制作用

,

因而存在一个经济合理的添加量及添加比例，实

验表明氮磷比在

5

∶

1~6

∶

1

比较适宜，

,

无机氮源比有机氮源好，硝酸盐形式的氮比铵态的

氮更合适。而国内有其他研究却更倾向于氮磷比为

1

：

1

，且最佳氮源为氯化铵，最佳磷源

为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。两种研究得出的结果不一致。

表面活性剂是影响降解效率的又一重要因素。表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和

分散作用，

从而对石油降解菌的降解效率有重要作用，

而有研究则指出表面活性剂对微生物

存在一定毒害作用。

刘庆新等通过研究，

表明表面活性剂的加量多少对石油烃降解菌的影响

比较复杂：

加少量的表面活性剂会促进石油烃降解菌的生长，

但随着表面活性剂加量的增加

,

菌量反而减少，证实了上述论断。

在自然环境中，大多数的石油烃类是在好氧条件下被降解的，但是微生物对石油烃的

降解在有氧及缺氧两种情况下都会进行，

最近有研究表明厌氧降解对饱和烃及芳香烃有着极

为重要的作用。

能降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜热菌和嗜中温菌，因此在温度低于

0

℃和在

70

℃左

右的环境中均有能降解石油的微生物，大多数石油降解菌属嗜中温菌，最适温度在

30

℃上

下，温度过高过低都会对降解效率产生抑制。

普遍认为石油降解菌是产酸菌，且适宜生长于中碱性环境中。刘庆新等研究得最佳

pH

值为

8.0

，而其文章中也指出与一般认为的

7.0

不符。而

Stapleton

[20]

等发现在

pH 2.0

的一处

土样中，萘和甲苯仍然被降解为

CO

2

和

H

2

O

。

6

生物降解石油烃污染物的应用

利用生物降解石油烃类污染物最早见于

20

世纪

80

年代末美国在

Exxon

Vadez

油轮

石油泄露的生物修复项目中，

该项目在短时间内清除了污染，

治理了环境，

是生物修复成功

应用的开端，同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用。

20

世纪

90

年代以来，生物

修复技术在石油污染治理方面逐渐成为核心，

取得了理论突破和重要成果。

国内学者也做了

大量工作，但主要为石油污染土壤和地下水的生物修复研究

[38]

，对海洋石油污染的生物修

复研究相对较少，

而且研究工作也大多停留在实验室模拟实验的水平上。

闫毓霞利用土著微

生物对胜利油田含油污泥进行修复实验；黄廷林等

[40]

对黄土地区石油污染土壤进行了室内

模拟生物修复研究。

石油降解菌在实际应用中存在着很多问题，集中表现在投加高效石油降解菌来处理污

染时：投加菌面临与土著微生物的竞争作用；投加菌需要适应新的生长环境；

投加菌要经

受环境污染物的毒性影响。这些压力使接种的外源微生物的存活率很低或者活性较弱

,

限制

了它的实际应用。

7

展望

石油降解菌降解石油烃类污染物具有物理、化学方法所不具备的优点，它高效、经济、

安全、

无二次污染，

在机械装置无法清除的薄油层而且化学药剂被限制使用时，

生物法处理

溢油的优越性便更加显著，

具有广阔的研究及应用前景。

目前国内外对石油降解菌的研究呈

现出一定特点：

(1)

对一般性降解菌研究多，对极端环境下的石油降解微生物研究少，尤其是对低温、

耐盐的石油降解菌。中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，常年气温（尤其冬季）气温

较低，

而无论是来源海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。

在这种条件下的石油降解

菌研究具有很广阔的前景。

(2)

对石油降解菌的研究多而应用少。

对石油降解菌的所有研究到最终肯定要归结到实

际应用中去，

目前国内很多学者都对石油降解菌的单纯研究感兴趣，

同时出现了大量的重复

研究。国外已有成功应用先例，证明石油降解菌可以用来修复实际污染，国内仍止步不前，

难于踏出实际应用的第一步。

随着大量学者的不断研究，对石油降解菌的认识肯定会不断深化，其应用也会逐渐成熟

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。

利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。

(一)细胞生长环境的优化策略

要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

1．培养基组成的优化

培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组-淀粉酶的产量可提高2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。

恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。

2．特殊营养物的添加

在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。

在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。

3．限制代谢副产物的积累

培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组-淀粉酶和-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。

(二)培养模式

由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。

1．大肠杆菌流加发酵策略

大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。

近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。

如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。

2．重组酵母的流加发酵

酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。

通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。

3．流加培养的控制

一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 mgg-1h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。

(三)诱导策略

对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。

如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。

比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。

(四)细胞循环发酵

从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。

操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。

细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。

在多种控制手段的帮助下，目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明，与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如，用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇，生物量提高了大约6倍，但体积生产率只提高了2～3倍。同样，流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L，但蛋白酶活为零，而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题，一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性，另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件.

微生物cod降解菌种是由硝化细菌、反硝化细菌、芽孢杆菌及活化酶等组成，通过生化池以污泥或填料为载体，形成生物膜或生物絮体，吸附有机物将其分解，转化为二氧化碳、水、氮气。

而化学需氧量（COD）是检测废水中有机物受污染的程度，化学需氧量耗氧越大，说明水体中受到有机物的污染越严重。

COD超标的处理方法

物理法：通过物理的作用来分离废水中的悬浮物等，例如格栅、气浮机、离心等等，去除一部分COD。

化学法：通过化学反应的作用来去除废水中的有机污染物等，例如电解法、氧化还原、沉淀等。

生物法：通过微生物的作用来降解有机污染物，例如氧化沟、氧化法、厌氧法等等，降解污水中的有机物污染物，如生物甘 度菌。

利用微生物在好氧池、厌氧池快速繁殖形成生物膜或者生物絮体来降解水体中的有机污染物。其特点如下：

1、  针对高低浓度cod处理，去除率达96%。

2、  强力去除BOD、COD、氨氮、总氮及TSS，显著的提高沉淀池内固体沉降能力。

3、  促进生化池新系统快速启动及老系统快速恢复，提高生化系统处理能力及抗冲击能力。

4、  增加原生动物的数量和多样性。

5、  在冬季低温仍有快速的繁殖能力以及处理能力、不错效果稳定。

6、  有效减少剩余淤泥产生量，减少絮凝剂等化学药品的使用，节省电力。

7、  消除硫化氢、氨氮等臭味气体及泡沫

高生产率和高细胞密度发酵生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。

利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。

(一)细胞生长环境的优化策略

要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。

1．培养基组成的优化

培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组-淀粉酶的产量可提高2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。

恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。

2．特殊营养物的添加

在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。

在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。

3．限制代谢副产物的积累

培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组-淀粉酶和-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。