包涵体的实验方法

肉毒杆菌食物中毒肉毒杆菌食物中毒（clostridium botulinum food poisining）,亦称肉毒中毒（botulism）,是因进食含有肉毒杆菌外毒素的食物而引起的中毒性疾病。临床上以恶心、呕吐及中枢神经系统症状如眼肌及咽肌瘫痪为主表现。如抢救不及时，病死率较高。由于肉毒杆菌外毒素的毒力极强，又可大量生产，能通过气溶胶使人中毒，战时敌方可能用作生物武器，应引起重视。（一）病原体：肉毒梭状芽胞杆菌（Clostridium botulinum）（简称肉毒梭菌，下同）系革兰阳性厌氧杆菌，有芽胞。广泛分布于土壤、江河湖海污泥中及鱼类和动物粪便中，借其芽胞可长期存活。耐高温，芽胞需干热180℃5～15分钟或湿热100℃6小时方被杀灭。10%盐酸1小时或20%甲醛24小时方能杀死芽胞。在适宜条件下（无氧、发酵、适宜的营养基质、18～30℃）下肉毒梭菌可迅速生长，大量繁殖，同时产生一种以神经毒性为主要特征的可溶性剧毒的内毒的肉毒毒素（外毒素）。根据其抗原结构可分为A、B、C、D、E、F、G7型。每一菌株仅能产生单一型毒素，其中A、B及E三型是引起人类发病的主要毒素，其毒性极强，口服0.01㎎即可致死。毒素对胃酸有抵抗力，但不耐热。A型毒素80℃、5分钟即可破坏，B型毒素88℃、15分钟可破坏。毒素在干燥、密封和阴暗的条件下，可保存多年。由于此毒素的毒性强，且无色、无臭、无味、不易查觉，必须注意防范。（二）流行病学：肉毒毒素除自肠道吸收外，也可通过呼吸道、眼结膜和破损皮肤侵入，而婴儿肉毒中毒的传播途径不清，有报道蜂蜜可能为传播媒介。本病在我国主要分布西部省区，以B型菌株为主，其次为A型，如不及时治疗，病死率较高（A型为60%～70%，B型为10%～30%，E型为30%～50%）①传染源家畜、家禽及鱼类为传染源。本菌芽胞广布于自然界，病菌由动物（主要是食草动物）肠道排出，污染土壤及岸沙土，由此污染饮食品制作罐头，如加热不足，则其所产芽胞不被消灭，加之缺氧环境，造成肉毒杆菌大量繁殖，产生大量外毒素。②传播途径主要通过食物传播，多见于腌肉、腊肉、猪肉及制作不良的罐头食品，部分地区曾因食用豆豉、豆瓣酱、臭豆腐、米送乎乎及不新鲜的鱼、猪肉、猪肝而发病。肉毒杆菌的繁殖，不一定需要不严格的乏氧条件及适当的温度，E型菌可在6℃低温繁殖并产生毒素；A型及B型菌能产生蛋白水解酶，使食物变质；而E型菌不产生此酶，食物可不变质，易疏忽而致病。战争环境中，敌方可利用肉毒毒素经气溶胶方式传播，广泛污染饮水，粮食及器物，如不及时处理，可造成集体中毒。③易感性：普遍易感，不引起人与人之间传染。我国北方地区，西部地区曾多次发生。所不完全统计，1949年～1991年9月全国共发生肉毒中毒998起（新疆718起），中毒人数3903人（新疆2259例），死亡510人，病死率为12.5%。（三）发病原理与病理变化：肉毒毒素是一种嗜神经毒素，主要由上消化道吸收，毒素进入小肠和结肠后，则吸收缓慢，胃酸及消化酶均不能将其破坏，故多数患者起病缓慢，病程较长。肉毒毒素吸收后主要作用于颅神经核，外周神经、肌肉接头处及植物性神经末梢，阻断胆硷能神经纤维的传导，神经冲动在神经末梢突触前被阻断，从而抑制神经传导介质——乙酰胆碱的释放，使肌肉收缩运动障碍，发生软瘫，但肌肉仍能保持对乙酰胆硷的反应性，静脉注射乙酰胆碱能使瘫痪的肌肉恢复功能。病理变化主要是颅神经核及脊髓前角产生退行性变，使其所支配的相应肌群发生瘫痪，脑干神经核也可受损。脑及脑膜显著充血、水肿，并有广泛的点状出血和血栓形成。显微镜下可见神经节细胞变性。（四）临床表现：潜伏期6小时～10天，一般1～4天。起病突然，病初可有头痛、头昏、眩晕、乏力、恶心、呕吐（E型菌恶心呕吐重、A型菌及B型菌较轻）；稍后，眼内外肌瘫痪，出现眼部症状，如视力模糊、复视、眼睑下垂、瞳孔散大，对光反射消失。口腔及咽部潮红，伴有咽痛，如咽肌瘫痪，则致呼吸困难。肌力低下主要见于颈部及肢体近端。由于颈肌无力，头向前倾或倾向一侧。腱反射可呈对称性减弱。植物神经末梢先兴奋后抑制，故泪腺、汗腺及涎腺等先分泌增多而后减少。血压先正常而后升高。脉搏先慢后快。常有顽固性便秘、腹胀、尿潴留。病程中神志清楚，感觉正常，不发热。血、尿与脑脊液常规检查无异常改变。轻者5～9日内逐渐恢复，但全身乏力及眼肌瘫痪持续较久。重症患者抢救不及时多数死亡，病死率30～60%，死亡原因多为延髓麻痹所致呼吸衰竭，心功能不全及误吸肺炎所致继发性感染，婴儿偶而吞入少量肉毒杆菌芽胞，在肠内繁殖，产生神经毒素，吸收后因骤发呼吸麻痹而猝死（婴儿猝死综合征the sudden infant death syndrome,SIDS）。（五）诊断：①有进食可疑食物，特别是火腿、腊肠、罐头或瓶装食品史，同餐者集体发病。②有特殊的神经系统症状与体征，如复视、斜视、眼睑下垂、吞咽困难，呼吸困难等。③确诊可用动物试验查患者血清及可疑食物中的肉毒毒素，亦可用可疑食物进行厌氧菌培养，分离病原菌。在战争环境中，须警惕敌人施入含肉毒素的气溶胶；如有可疑，可将气溶胶从附着处洗下，进行动物试验。动物试验①取早期血清注入小白鼠（或豚鼠、小猫）腹腔，每鼠1毫升，对照组分别加用A、B、E、F型抗毒素，如有肉毒毒素，则小白鼠出现呼吸困难及蜂腰（腰部凹下如蜜蜂）和失声，但加用同型抗毒素者无症状。②取可疑食物生理盐水浸出滤液，用上述方法注入小白鼠腹腔，观察结果，另外以经100℃加热20分钟灭毒的浸出滤液为对照。③禽类眼睑注射法，将标本液0.1～0.5毫升注射于鸡、麻雀或鸽子等一侧下眼睑皮下，另侧注射稀释用液作对照。如眼睑闭合，可判定标本中含有肉毒毒素。根据标本中毒素量不同，检出时间从十几分钟到48小时不等。如将不同型别的抗毒素分别加入标本液，则可借以判定毒素的型别。间接血凝试验用肉素抗毒素致敏的红细胞来检查可疑食物浸出液有无毒素，特异性及敏感度都很低高。鉴别诊断：与脊髓灰质炎、白喉后神经麻痹、流行性乙型脑炎、急性多发性神经根炎、毒蕈及葡萄球菌肠毒素中毒等相鉴别。（六）治疗：①抗毒素治疗多价肉毒素（A、B、E型）对本病有特效，必须及早应用，在起病后24小时内或瘫痪发生前注意最为有效，剂量每次5～10万单位，静脉或肌肉注射（先做血清敏感试验，过敏者先行脱敏处理），必要时6小时后重复给予同量1次。在病菌型别已确定者，应注射同型抗毒素，每次1～2万单位。病程已过二日者，抗毒素效果较差，但应继续注射，以中和血中残存毒素。②对症治疗：患者应严格卧床休息，并予适当镇静剂，以避免瘫痪加重。患者于食后4小时内可用5%碳酸氢钠或1：4000高锰酸钾溶液洗胃及灌肠，以破坏胃肠内尚未吸收的毒素。咽肌麻痹宜用鼻饲及输液。呼吸困难者吸氧，及早气管切开，呼吸麻痹者用人工呼吸器。为消灭肠道内的肉毒杆菌，以防其继续产生肠素，可给予大剂量青霉素。还应根据病情给予强心剂及防治继发性细菌感染等措施。出院后10～15天内应避免体力劳动。③化学疗法：近年有人采用盐酸胍（Guanidine hydrochloride）35～50毫克/公斤/日，分4～6次口服。据报道有促进末梢神经纤维释放乙酰胆硷的作用，因而能改善神经肌肉传递功能，增加肌张力，缓解中毒症状。（七）预防：严格管理与检查食品，尤应注意罐头食品、火腿、腌腊食品的制作和保存。食品罐头的两端若有膨隆现象，或内容物色香味改变者，应禁止食用和禁止食用，即使煮沸也不宜食用。谷类及豆类亦有被肉毒杆菌污染的可能，因此禁止食用发酵或腐败的食物。在战争情况下，应慎防敌人散布肉毒毒素的气溶胶污染饮水，引起集体中毒。遇有同食者发生肉毒素中毒时，其余人员应立即给予多价精制肉毒抗毒血清预防，1000～2000u皮下注射，每周1次，共3次。经常食用罐头者，可考虑注射肉毒杆菌类毒素。

P8思考题：1、5、6

1、 生物分离工程：是指从发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。P1

2、 生物分离纯化过程的一般流程可分为几大部分?分别包括哪些单元操作？P4

答：一、发酵液的预处理（固液分离）：单元操作：过滤和离心；

二、产物的提取（初纯化）：单元操作：沉淀、吸附、萃取、超滤；

三、产物的精制（高度纯化）：单元操作：层析（包括柱层析和薄层层析）、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱；

四、成品的加工处理：单元操作：浓缩、结晶和干燥；

3、 生物分离工程的特点有哪些？P6

答：①原料液体系非常复杂，杂质含量高，难于分离；②原料液一般为产物浓度很低的水溶液；③原料液抗环境变化能力差，容易变性失活；④分离过程必须保持目标物的生物活性；⑤分离粗产物纯度低，最终产品纯度要求极高，而对与人类生命息息相关的生物产物的质量要求必须达到国家相关标准；⑥常无固定操作方法可循；⑦分离操作步骤多，不易获得高收率；⑧对于基因工程产品，一般要求在密封环境下操作；⑨分离纯化过程代价昂贵，产品回收率低。

第二章 发酵液的预处理

1、 发酵液预处理的方法：P11

按预处理的目的分为：提高过滤速度的方法、改变发酵液性质的方法和杂质去除的方法

具体的方法有：凝集和絮凝、加热法、调节PH法、加水稀释法、加入助滤剂法、加吸附剂法或加盐法、高价态无机离子去除的方法、可溶性杂蛋白质去除的方法、色素及其他杂质去除的方法。

2、 凝集：指在投加的化学物质(如水解的凝集剂、铝、铁的盐类或石灰等)作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为1mm大小块状絮凝体的过程。P11

3、 絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。P12

4、 具体方法中常采用的物质试剂：P14~15

调节PH法：一般采用草酸等有机酸或某些无机的酸碱；

高价态无机离子去除的方法：

①、 Ca2＋的去除：常采用的酸化剂为草酸；

②、 Mg2＋的去除：采用加入磷酸盐，是Mg＋生成磷酸镁沉淀的方法；

③、 Fe3＋的去除：采用加入黄血盐，生成普鲁士蓝沉淀的方法。

5、 影响发酵液过滤的因素：P17

一、 菌种：决定发酵液中各种悬浮粒子的大小和形状；

二、 发酵液黏度：通常发酵液黏度越大，分离速度越慢

影响其因素有：①发酵条件、②放罐时间、③发酵染菌、④发酵液的PH、温度

6、 错流过滤：料液流动方向与过滤介质平行的过滤，常用的过滤介质为微孔滤膜或超滤膜，主要适用于悬浮粒子细小的发酵液，如细菌发酵液的过滤。P18

7、 发酵液的过滤设备：

按过滤的推动力分为：重力式过滤器、压力式过滤器、真空式过滤器和离心式过滤器四种。P23

第三章 细胞分离技术

1、 细胞破碎的方法：P34 根据破碎机理不同，可分为：

⑴机械破碎法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法和其他类型的机械破碎法；

⑵物理破碎法：冻融法、低温玻璃化法；

⑶化学渗透法：酸碱法、盐法、表面活性剂处理、有机溶剂法、变性剂法、温和化学渗透剂处理；

⑷酶溶法：降解细胞壁。

2、 变性剂的作用：变性剂（如盐酸胍和脲）的加入，可削弱氢键的作用，使胞内产物相互之间的作用力减弱，从而易于释放。P38

3、 包含体：是聚集蛋白质形成的浓密颗粒（密度达1.3mg/ml），可在光学显微镜下观察到，直径可达μm级，呈无定形或类晶体。

4、 蛋白质复性：又称再折叠，是指变性蛋白质在变性剂去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热不稳定状态向热稳定状态转变，形成具有生物学功能的天然结构。P42

复性方法：①稀释与透析复性法、②色谱复性技术、反胶束萃取复性法。

第四章 沉淀技术

1、 沉淀：又称为沉析，是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。P48

2、 蛋白质沉淀方法：P51

盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、非离子多聚物沉淀法、生成盐复合物法、选择性的变性沉淀、亲和沉淀及SIS聚合物与亲和沉淀等。

3、 盐析：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，以致从溶液里沉淀出来的现象。P51

4、 盐析原理：在蛋白质溶液中加入大量中性盐后，破坏蛋白质分子上的亲水基团与水分子作用形成的水化层，夺走水分子，破坏水膜，暴露出疏水区域，同时中和电荷，使颗粒间的相互斥力丧失，布朗运动加剧，导致蛋白质分子相互结合成聚集物而沉淀析出。P51

5、 影响盐析的因素：P52

① 蛋白质种类、②离子类型、③温度和PH、④盐的加入方式、⑤蛋白质的原始浓度。

6、脱盐处理的方法：透析法、超滤及凝胶过滤法。P55

7、有机溶剂沉淀法的原理：P56

一传统观点：在蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等有机溶剂，水的活度降低，水对蛋白质分子表面的水化程度降低，即破坏了蛋白质表面的水化层；另外，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而聚集和沉淀。

二新观点：有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，而当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性。

第五章 萃取技术

1、萃取：是利用溶质在互不相溶的溶剂里的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液（原料）中提取出来的方法。P64

2、分配定律：在恒温恒压条件下，溶质在互不相溶的两相中分配时，达到分配平衡后，如果其在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为一常数，此常数称为分配常数A，A=c1/c2 P64

3、分配常数在使用时，必须注意满足3个条件：P65

①必须是稀溶液；②溶质对溶剂的互溶度没有影响；③溶质在两相中必须是同一分类型，不发生缔合伙离解。

4、工业上液液萃取的基本过程包括几个步骤：P67

①混合：料液与萃取剂充分混合并形成乳浊液的过程，设备：混合器；

②分离：将乳浊液分开形成萃取相和萃余相的过程，设备：分离器；

③溶剂回收：从萃取相或萃余相中回收萃取剂的过程，设备：回收器。

5、按操作流程划分，液液萃取可分为：P67

①单级萃取，②多级萃取：多级错流萃取和多级逆流萃取。

6、影响有机溶剂萃取的因素：P73

一水相条件的影响：影响萃取操作的因素：主要有PH、温度、无机盐等

①PH ②温度 ③盐析 ④带溶剂

二有机溶剂的选择

三乳化现象：乳化是一种液体分散在另一种不相混合的液体的现象。P75

7、去乳化剂有两种：①阳离子表面活性剂溴代十五烷基吡啶，适用于破坏W/O型乳浊液；

②阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠，易溶于水，微溶于有机溶剂，适用于破坏W/O型乳浊液。P75

8、 聚合物的不相溶性：两种聚合物分子间如存在相互排斥作用，即某种分子的周围将聚集同种分子而非异种分子，达到平衡时，就有可能分成两相，而两种聚合物分别进入一相中的现象。P80

9、在生化工程中得到广泛应用的双水相体系主要是：聚乙二醇-葡聚糖体系和聚乙二醇-无机盐系统。P80

10、液膜分离系统的膜相组成：通常有膜溶剂、表面活性剂、流动载体、膜增强剂构成。P87

11、液膜分类：根据其结构可分为3种 P87

①乳状液膜，②支撑液膜，③流动液膜

12、液膜萃取机理：根据待分离溶质种类的不同，可分为以下几种类型。P89

一单纯迁移：

二促进迁移：

三载体输送：

13、流动载体的选择原则：①溶解性，②络合性，③稳定性。 P92

14、溶胀：是指外相水透过膜进入了液膜内相，从而使液膜体积增大的现象。P94

15、反胶团：若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团。P99

16、反胶团的优点：P99

⑴极性“水核”具有较强的溶解能力；

⑵生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用；

⑶由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。

17、反胶团萃取蛋白质的推动力：萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂性头间的静电相互作用是主要推动力。P100

18、液固萃取的过程：包括润湿、溶解、扩散、和置换，其中置换中浸取的关键在于保持最大的浓度梯度。P103

19、超临界流体特点：P107

⑴在临界点的附近，密度线聚集于临界点周围，压力或温度的小范围变化，就会引起流体密度的大幅度变化；

⑵超临界流体的密度和溶剂化能力接近液体，黏度和扩散系数接近气体，在临界点附近流体的物理化学性质随温度和压力的变化极其敏感，在不改变化学组成的条件下，即可通过压力调节流体的性质；

⑶在临界点附近，会出现流体的密度、黏度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象。

20、超临界流体萃取的原理：P107

它是利用超临界流体(SCF)，即温度和压力略超过或靠近临界温度(Tc)和临界压力（Pc）、介于气体和液体之间的流体，作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化的目的。

21、超临界流体萃取的典型流程有：等温法、等压法和吸附法。P113

第六章 膜分离过程

1、膜分离过程：是用具有选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力（如压力差、浓度差、电位差、温度差等）作用下，原料液体混合物或气体混合物中的某个或某些组分选择地透过膜，使混合物达到分离、分级、提纯、富集和浓缩的过程。P120

2、膜的功能：①物质的识别与透过；②相界面；③反应场。

3、浓差极化：较高的压力和料液浓度以及缓慢的膜面流速可造成膜表面溶质浓度高于主体浓度，形成高浓度边界层，使料液侧膜面的渗透压升高，有效压差减小的现象。P127

4、凝胶极化：是指在膜分离的过程中，由于溶质受到膜的截留作用，不能完全通过膜，溶质在膜表面附近浓度升高，导致膜两侧的有效压差减少，膜的通透量降低，当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质析出，并在膜的表面形成凝胶层的过程。

5、超滤和微滤：是以膜两侧压力差为推动力，以微孔膜为过滤介质，当溶液流过膜表面时，主要利用筛分原理将溶液中的悬浮粒子或大分子物质截留，而使溶剂和小分子物质透过膜，以实现净化、分离与浓缩的膜分离过程。P132

微滤膜：一般为均质膜，膜阻力由总的膜厚度决定，微滤膜相比超滤膜来说孔径较大且孔径分布较均匀，膜孔径为0.05~10µm，截留对象是细菌、胶体以及气溶胶等悬浮粒子；超滤膜：一般为不对称结构，膜的传质阻力主要在表皮层，其厚度仅为1µm或更小，孔径大多在0.005~0.05µm，截留对象是相对分子质量为10³~10^6的溶质。

6、影响截留率的因素：

⑴溶质的分子量；

⑵分子特性：①球形＞带支链＞线性分子；

②对于荷电膜与膜相反电荷分子截留率低，若膜对溶质有吸附作用，截留率高；

③其他高分子溶质存在，使截留率增大；

④操作条件：当PH=PI时，蛋白质截留率Ro高；温度升高，Ro降低。

7、电渗析的基本原理：P139

注：自己看书结合图示总结

第七章 吸附与离子交换

1、吸附：是指溶质从液相或气相转移到固相的现象。P154

2、活性炭：是一种非极性吸附剂，在水中的吸附能力大于在有机溶剂中的吸附能力。针对不同类型的物质，具有一定的规律性：①对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物；②对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物；③对相对分子质量大的化合物的吸附能力大于相对分子质量小的化合物。P156

3、大孔网状吸附剂：是一种非离子型共聚物，是借助于范德华力从溶液中吸附各种有机化物质。具有选择性好、解析容易、机械强度高、使用寿命长、流体阻力较小、吸附质容易脱附、吸附速度快等优点。P157

4、离子交换剂的构成：网络骨架(具有三维空间立体结构)、活性基团和可交换的离子（与网络骨架带相反电荷）构成。P158

5、交换容量：是表征离子交换剂交换能力的主要的参数，是单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数（mmol）。P158

6、影响交换速度的因素：P164

⑴颗粒大小：颗粒减小无论对内部扩散控制或外部扩散控制的场合，都有利于交换速度的提高；

⑵交联度：交联度越低树脂越易膨胀，在树脂内部扩散越容易，当内扩散控制时，降低树脂交联度，能提高交换速度。树脂交联度大，树脂孔径小，离子运动阻力大，交换速度慢；

⑶温度：溶液温度提高，扩散速度加快，交换速度也增加；

⑷离子的化合价：离子化合价越高，离子和树脂骨架间的库仑力越大，扩散速度越小；

⑸离子的大小：小离子的交换速度比较快；

⑹搅拌速度：当液膜控制时，增加搅拌速度会使交换速度增加，但增大到一定程度后再继续增加转速，影响就比较小；

⑺溶液浓度：当溶液浓度为0.001mol/L时，一般为外扩散控制，当溶液浓度增加时，交换速度也按比例增加。当浓度达到0.01mol/L左右时，浓度再增加，交换速度增加的较慢。此时内扩散和外扩散同时起作用，当浓度继续增加，交换速度达到极限值后就不再增大，此时已转变为内扩散控制。

7、影响离子交换选择性的因素：P165

⑴水合离子半径：半径越小，亲和力越大；

⑵离子化合价：高价离子易于被吸附；

⑶溶液PH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；

⑷离子强度：越低越好；

⑸有机溶剂：不利于吸附；

⑹交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；

⑺树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力。

第八章 色谱分离技术

1、阻滞因素：又称迁移率，是指一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf(Rf≤1)表示。P177

2、正向色谱：是指固定相的极性高于流动相的极性，在这种色谱过程中，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出来；

反向色谱：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快，而先从柱中流出。P179

3、色谱法的分类：根据分离原理的不同分类 P181

可以分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。

4、显色的方法：P189

⑴碘蒸气显色；⑵紫外线显色；⑶喷雾显色。

5根据载体多糖种类的不同，多糖基离子交换剂可分为：P197

①离子交换纤维素；②离子交换葡聚糖；③离子交换琼脂糖。

6、亲和色谱原理：P206

将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基(配体)，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质及配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。

7、蛋白质A来源于金黄色葡萄球菌，蛋白质G分离自G群链球菌。P208

8、辅酶和磷酸腺苷：某些酶（如脱氢酶和激酶）需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和配基。P208

9、活化：载体上的化学基团是不活泼的，不能与配基直接偶联，通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。P211

10、洗脱方法：⑴特异性洗脱；⑵非特异性洗脱。P219

第九章 离心技术

1、离心机的转子的类型：有甩出式水平转子、角转子、垂直转子、（区带转子、细胞洗脱转子、分析转子）等。P237

2、计算：

①悬浮微粒在重力场中重力沉淀速度Vg的计算公式：P233 9-4

②例题9-1

③料流量Q的计算公式：P244 9-19

④例题9-3

⑤注：ω=2πn／60

第十章 浓缩、结晶与干燥

1、蒸发浓缩：是利用加热的方法使溶液中的一部分溶剂（通常为水）汽化后除去，得到含较高浓度溶质的一种操作过程。P267

2、结晶：是溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体的过程，它是溶质提纯和得到固体颗粒的一种方法。P281

3、结晶的一般步骤：

⑴过饱和溶液的形成；⑵晶核产生；⑶晶体生长。

4、二次成核：已被认为是晶核的主要来源，其中起决定作用的两种机理为：液体剪应力成核和接触成核。P283

5、喷雾干燥：是利用雾化器将料液(含水50％以上的溶液、悬浮液、浆状液等)喷成雾滴分散于热气流中，使水分迅速蒸发而成为粉粒状干燥制品的一种干燥方式。P302

6、冷冻干燥：又称升华干燥，是指将待干燥物快速冻结后，再在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气而去除的干燥方法。由于冰的升华带走热量使冻干整个过程保持低温冻结状态，有利于保留一些生物样品(如蛋白质)的活性。

生化物质常用的提取方法

1.酸、碱、盐水溶液提取法

用酸、碱、盐水溶液可以提取水溶性、盐溶性的生化物质。该类溶剂提供了一定的离子强度、ph及相当的缓冲能力。如胰蛋白酶用稀硫酸提取，肝素用ph9的3%气化钠溶液提取，某些与细胞结构结合牢固的生物高分子，采用高浓度盐溶液提取(如4mol/l盐酸胍，8mol/l脉或其他变性剂)。同时这类方法也被称作为“盐解”。

2.表面活性剂提取法

表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，在分布于水—油 界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂又称“去垢剂”，可分为阳离子型、阴离子型、中性与非离子型去垢剂离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子型表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。

某些阴离子去垢剂如十二烷基硫酸钠(sds) 等可以破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，常用于核酸的提取。

注意：使用去垢剂时应注意它的亲油、亲水性能的强弱，通常以亲水基与亲油基的平衡值(h.lb)表示。

生物提取常用的表面活性剂，其h.l.b多在10~20之间，除十二烷基硫酸钠(sds)外，实验室中常见的还有吐温类(tween 20、40、 60、 80)、 span 和triton系列，以及十六烷基二乙基溴化铵等。离子型表面活性剂的化学本质多为高级有机酸盐、季铵盐、高级醇的无机酸酯。非离子表面活性剂多为高级醇醚的衍生物。

在适当ph及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。微泡的形成严格地依赖于ph与温度。一般说离子 型比非离子型更有效。虽然它易于导致蛋白质变性，甚至使肽键断裂，但对于膜结合酶的提取，如呼吸链的一些酶及乙酰胆碱酯酶等， 还是相当有效的。

表面活性剂的存在对酶、蛋白等的进一步纯化带来一定困难，如盐析时很难使蛋白质沉淀，因此，需先除去。离子型表面活性剂可用离子交换层析法除去，非离子型表面活性剂可以用sephadexlh-50层析法除去，其他表面活性剂可以用分子筛层析法除去。如采用deae-sephadex柱层析纯化样品，则不必预先去除表面活性剂。经层析获得的蛋白质样品可用盐析或有机溶剂分部沉淀，十二烷基硫酸钠处理菌体悬浮液时,浓度一般为1%左右，低温放置12h即可。