玫瑰花的树枝有蜡怎么办

我在做蛋白质分离纯化,其中一步用到乙醇沉淀,操作如下：

1、将蛋白质溶液和无水乙醇4摄氏度预冷；

2、调pH至目的蛋白的等电点（6.9）；

3、在磁力搅拌器的搅拌下缓缓加入冰冷的乙醇,乙醇终浓度为60%；

4、4℃静置30min后,离心、弃上清；

5、晾干沉淀、用pH8.0的Tris-HCl Buffer回溶.

问题是回溶时候十分难溶,即使好不容易将沉淀溶解了,溶液也是浑浊的,不澄清.请战友们分析一下会是什么原因啊? 大家在这里讨论一下乙醇沉淀的有关技术吧,谢谢啦!

以胶体形式分散在溶液中的蛋白,被乙醇破坏水化膜后而沉淀,部分蛋白可以复溶,这与具体的蛋白组分有关,也与你操作方式有关,如乙醇的浓度、温度、沉淀时间等.

沉淀不溶解并不是异常现象,我个人理解这正是实验所需要的,经过复溶后可以将不溶解的蛋白进行分离,这难道不是你要的结果吗?关键是你的目标蛋白是在那个组分中,如果是在不溶解组分中,可能需要调整你的实验方法,详细分析乙醇浓度与蛋白沉淀的关系.

回：shijs老师——

我在调节蛋白质溶液的等电点时发现蛋白质溶液的pH从8.0调至6.9的过程中,伴随着HCl的加入,有明显的沉淀产生,我想是不是这些沉淀导致了最后的回溶效果不好?于是我调完等电点之后,就把我的蛋白质溶液离心了,离心沉淀就是加酸过程中产生的沉淀,我将这些沉淀用Buffer回溶,发现的确是非常难溶,即使溶解了也是白茫茫的十分浑浊.难道是酸变性?有什麽办法解决之吗?

1.1 样本来源 静脉抽取30份健康体检者血样。10份用EDTA抗凝, 10份不加抗凝处理，10份不抗凝在-40 ℃冻存2 a左右。

1.2 DNA提取方法 取凝血块，用9 g/L 氯化钠匀浆大约30 s，每换一个样本都要用70%乙醇和9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染。取匀浆后样本1 ml置于离心管中，室温8 000 r离心5 min后，去掉上层。血细胞在1 ml的Tris缓冲液I(10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；25 mL/L Triton X�100)中裂解10 min, 其间轻轻用力充分混匀, 室温10 000 r离心2 min，沉淀要用Tris 缓冲液I洗2次。将沉淀用220 μl的Tris 缓冲液II (10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.4 mol/L 氯化钠；10 g/L SDS)悬浮，轻轻振荡试管, 使底部细胞团块散开，在56 ℃保温15 min裂解。加入100 μl 5 M 氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质。10 000 r离心5 min，取上清。加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA后，10 000 r离心5 min，弃上清。室温晾20 min左右待酒精挥发干净后以适量TE缓冲液(10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA)回溶。EDTA抗凝血中DNA的提取从去掉上层开始。

1. 3 DNA浓度检测 用分光光度计在260 nm测DNA浓度。

1. 4 DNA纯度检测 DNA的纯度用A260/A280比值表示［3］。结果以均值±SD表示。

1. 5 DNA分子量检测 DNA样本的完整性用0.7%琼脂糖凝胶电泳证实，溴化乙锭染色，紫外灯观察。

1. 6 PCR检测 PCR扩增组织型纤溶酶原激活因子(t�PA)第8内含子Alu等位基因插入(I)和缺失(D)二态性［6］来评价DNA的可靠性。PCR引物序列如下：Alu1 5'�GTA AGA GTT CCG TAA CAG GAC AGC T�3', Alu2 5'�CCC CAC CCT AGG AGA ACT TCT CTT T�3'。反应体系组成为：10×PCR buffer 5 μl , 25 mM 氯化镁 6 μl , 10 mM each dNTPs 1 μl , 10 μM primer上下游各1 μl , DNA 2 μl ，Taq酶1 μl 。PCR反应程序为：95 ℃5 min预变性，然后94 ℃ 1 min ,58 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min循环40次，在72 ℃充分延伸10 min。

1. 7 结果 以均值±SD表示。

2 结果

凝血和抗凝血的DNA产量和纯度(A260/A280)相似。这些数据和用蛋白酶K处理及有机溶剂提取的相似［7］，比其他盐析程序报道的要高［1，5，7］，见表1。

表1 从冻存的和新鲜的凝血以及EDTA抗凝血中提取的DNA的浓度和A260/A280比值（略）

凝胶电泳显示所有样本的DNA分子量都很高(图1)，而且从两者的DNA样本中能很容易地扩增出t�PA基因的第8内含子区�Alu等位基因二态性(图2)。这些表明，此方法能有效地从血液中提取出基因组DNA。

图1 抗凝血、凝血和冻存凝血DNA提取比较。抗凝血DNA(1-2)、凝血DNA(3-5)和冻存凝血(6-8)DNA琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析。M－DNA Marker(λ�EcoT14 I digest, 购自TaKaRa)。（略）

图2 PCR扩增 t�PA 8th 内含子Alu等位基因插入/缺失(I/D)二态性结果。lane1、3、6为I/I；lane2为D/D；lane4、5为I/D。（略）

（1）

将冰冻的血在室温下溶化；

（2）

取1ml血液转入一无菌的2ml离心管中，加入等体积的pbs磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min，弃上清；

（3）

加入667µl

ste，24µl的20%的sds，37℃水浴1h；

（4）

加10µl的20mg/ml的蛋白酶k混匀，55℃水浴消化过夜（10～14h）；

（5）

将消化的样品加入等体积的tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；

（6）

将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；再加入等体积的tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；

（7）

将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；并加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），旋涡振荡至充分混匀，12000rpm离心10min；

（8）

将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；并加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），充分振荡混匀，12000rpm离心10min；

（9）

将上清液转移到另一无菌2ml离心管中；加入2倍体积的冰乙醇，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状dna析出；

（10）

将样品置-20℃冰箱冷冻30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm离心10min，使dna沉淀；

（11）

用枪头将dna挑到另一无菌离心管中，用适量的70%乙醇洗涤并晃动，以洗出dna的杂质；

（12）

倒出乙醇，将dna用真空干燥或自然晾干，加入适量的te缓冲液回溶，-20℃保存备用。

紧接着在1952年，美国卡内基遗传学实验室的科学家A．D．Hershey和他的学生共同发表报告，肯定了Avery 的结论。他们的实验材料是T2噬菌体。

最伟大的模型在1953年被提出来了，就是DNA双螺旋结构模型，我们应该记住两位创立者的名字——J．Watson 和F．Crick 。随着研究的深入，现在我们已经知道，在生物界并非所有的基因都是由DNA构成的。某些病毒和噬菌体，它们遗传体系的基础是RNA，而不是DNA。例如，A．Gierer 和G．Schramm 在研究烟草花叶病毒时，首先发现了RNA分子能够传递遗传信息，同时他们还发现烟草花叶病毒的RNA成分在感染的植株叶片中能够诱导合成新的病毒颗粒。

到现在，基因已经是以一种真正的分子物质呈现在我们面前，再也不是一种神秘成分了。科学家可以像研究其它大分子一样，客观地探索基因的结构和功能。

【血液中DNA的提取方法】

（1） 将冰冻的血在室温下溶化；

（2） 取1ml血液转入一无菌的2ml离心管中，加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min，弃上清；

（3） 加入667µl STE，24µl的20%的SDS，37℃水浴1h；

（4） 加10µl的20mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜（10～14h）；

（5） 将消化的样品加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；

（6） 将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；再加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12000rpm离心10min；

（7） 将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；并加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），旋涡振荡至充分混匀，12000rpm离心10min；

（8） 将上层水相转入另一无菌2ml离心管中；并加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），充分振荡混匀，12000rpm离心10min；

（9） 将上清液转移到另一无菌2ml离心管中；加入2倍体积的冰乙醇，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状DNA析出；

（10） 将样品置-20℃冰箱冷冻30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm离心10min，使DNA沉淀；

（11） 用枪头将DNA挑到另一无菌离心管中，用适量的70%乙醇洗涤并晃动，以洗出DNA的杂质；

（12） 倒出乙醇，将DNA用真空干燥或自然晾干，加入适量的TE缓冲液回溶，-20℃保存备用。

(1).浓盐法

利用rnp和dnp在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1m氯纳提取化钠抽提,得到的dnp粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而dna位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将dna钠盐沉淀出来.

也可用0.15mnacl液反复洗涤细胞破碎液除去rnp,再以1mnacl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

以稀盐酸溶液提取dna时,加入适量去污剂,如sds可有助于蛋白质与dna的分离。在提取过程中为抑制组织中的dnase对dna的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15mnacl,0.015m柠檬钠,并称ssc溶液,提取dna.

（2）.阴离子去污剂法:

用sds或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取dna.由于细胞中dna与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取dna.

（3）.苯酚抽提法:

苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了dnase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与dna联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含dna的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀dna。此时dna是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的dna保持天然状态.

（4）.水抽提法:

利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去rna，然后将沉淀溶于水中，使dna充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6m.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得dna样品.此法提取的dna中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入sds.

1.2 DNA提取方法 取凝血块,用9 g/L 氯化钠匀浆大约30 s,每换一个样本都要用70%乙醇和9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染.取匀浆后样本1 ml置于离心管中,室温8 000 r离心5 min后,去掉上层.血细胞在1 ml的Tris缓冲液I(10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA,pH 8.0；25 mL/L Triton X?100)中裂解10 min, 其间轻轻用力充分混匀, 室温10 000 r离心2 min,沉淀要用Tris 缓冲液I洗2次.将沉淀用220 μl的Tris 缓冲液II (10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA,pH 8.0；0.4 mol/L 氯化钠；10 g/L SDS)悬浮,轻轻振荡试管, 使底部细胞团块散开,在56 ℃保温15 min裂解.加入100 μl 5 M 氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质.10 000 r离心5 min,取上清.加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA后,10 000 r离心5 min,弃上清.室温晾20 min左右待酒精挥发干净后以适量TE缓冲液(10 mmol/L Tris?HCl,pH 8.0,1 mmol/L EDTA)回溶.EDTA抗凝血中DNA的提取从去掉上层开始.

病毒名称：香蕉束顶病毒Bananabunchytopvirus（BBTV）。

分类地位：香蕉束顶病毒属Babuvirus，矮缩病毒科Nanoviridae。在国际病毒分类委员会（ICTV）中的编码为00.093.0.02.001。

病毒异名：Abacabunchytopvirus。

病毒提纯：提取液为0.2mol/L（pH7.4）磷酸钾缓冲液（含0.2%琉基乙醇和0.1%二乙基二硫氨基甲酸盐），1g病组织与2倍体积提取液混合，研磨后用两层纱布过滤，滤液经7000r/min低速离心15min后，上清液经36000r/min超速离心2.5h（Beckman45Ti转头），沉淀用适量0.07mol/L（pH7.2）磷酸钠缓冲液悬浮，于4℃搅拌2d并放置2d，悬浮液低速离心后取上清液再超速离心，其沉淀用小量0.07mol/L（pH7.2）磷酸钠缓冲液悬浮后进行硫酸铯密度梯度离心，分别测定各分部260nm的吸光度值及间接DAS-ELISA的490nm吸光度值，合并与BBTV抗体有免疫反应的部分，再经超速和低速交叉离心即可获纯化的BBTV制品。

另外的病毒提纯程序：病组织加入0.2mol/L（pH7.4）磷酸钾缓冲液（内含0.01mol/LEDTANa2，1%β-巯基乙醇）匀浆（3ml提取缓冲液/g病组织），匀浆液经两层纱布过滤，滤液中加入1/4体积的氯仿和正丁醇混合物（1∶1），置冰浴中搅拌乳化40min，6000r/min离心15min，于上清液相中加入3%NaCl和7%的PEG（分子量6000），4℃沉淀12h，8000r/min离心30min，弃上清液，用0.01mol/L（pH7.4）磷酸钾缓冲液溶沉淀，经9000r/min离心15min，其上清液相置MSE-75型超速离心机上40000r/min离心90min，以少量0.01mol/L（pH7.4）磷酸钾缓冲液回溶沉淀，8000r/min离心10min，去杂蛋白，其上清液相即为粗提取病毒液。粗提取病毒液经蔗糖密度梯度离心进一步纯化。蔗糖梯度为40%、30%、20%、10%，配制蔗糖梯度的缓冲液为0.01mol/L（pH7.4）磷酸钾缓冲液。于MSE-75型超速离心机上23000r/min离心3h，分步收取梯度液。

病毒理化特性：

①病毒粒子。圆形等轴20面体，直径18～20nm，也有报道为22～23nm，无包膜，粒子之间无特异性的排布。A260/A280为1.30～1.47。

②核酸。环状单链DNA，多分体病毒，含有至少6个大小在1.0～1.1kb的ssDNA组分，并分别包装在不同的病毒粒体内，分子质量2.0*106u。田娥等人首次完整报道了我国BBTV的6个DNA组分全序列。

③蛋白。分子质量为20ku。DNA1编码一个33.5ku的复制酶蛋白和一个15.2ku的未知蛋白，DNA3编码一个20ku的外壳蛋白，DNA4编码一个含30个氨基酸疏水区的蛋白，DNA5的编码蛋白与成视网膜瘤（Rb）蛋白有结合的活性，DNA6编码的蛋白起到一个核穿梭蛋白（NSP）的作用。而DNA2由于未找到一个合适的阅读框，认为该组分不编码任何蛋白。

株系：近来的研究表明，根据其基因组ssDNA的同源性可分为两类种群。一类是以菲律宾、越南和我国台湾分离物为代表的，在越南GiantCavendish（AAA）香蕉上发现的两种束顶症状，研究者把两者分别称为香蕉株系和马尼拉麻株系，后者造成叶片的不规则生长和明脉。马尼拉麻束顶病毒Abacabunchytopvirus，ABTV在菲律宾商业种植的麻蕉上产生的症状与BBTV相同，很可能是同一种病毒。ABTV在植株上产生黄化症状，通过香蕉交脉蚜非持久性传播。香蕉束顶病毒同样可以侵染马尼拉麻，并产生与ABTV相似的症状。

另一类则以澳大利亚、南太平洋、非洲和印度分离物为代表。云南分离物与澳大利亚的香蕉束顶病毒抗血清及中国台湾的单克隆抗体均呈阳性反应。

中国报道有4个株系。广东报道为NS和NSP株系，福建报道为S（重型）和M（轻型）株系。