Folin-酚法测蛋白质的原理和操作

实验原理：

采用Folin-酚法测定，Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）组成。多肽中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与多肽含量成正比[28]。

实验所需试剂的配置：

(1) 试剂甲：(A) ：10g Na2CO3,2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），溶解于500mL去离子水。(B) ：0.5g 硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100mL 去离子水中；将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。

(2) 试剂乙：将Folin-酚试剂与去离子水按1:1混合。

(3) 标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白，溶于去离子水中，浓度为250μg/mL左右。牛血清蛋白溶于水，若混浊，可改用0.9%（质量分数）NaCl溶液。

(4) 样品溶液：通常根据样品中蛋白含量的不同，样品在测定前需要进行适当倍数的稀释。

实验步骤：

(1) 标准曲线的测定: 取16支大试管，1支作空白，3只留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL标准蛋白质溶液（浓度为250μg/mL）。用水补足到1.0 mL，然后每支试管加入5mL试剂甲，在漩涡混合器上迅速混合，于室温（20-25℃）放置10 min。再向各个试管加入0.5mL试剂乙，同样立即混合。然后在室温下放置30 min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各试管中溶液的吸光度值，以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

(2) 样品的测定：取1mL 样品溶液（其中蛋白质含量约20-25μg），按上述方法进行操作，取1mL水代替样品作为空白对照。

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。

可能是你资料来源有误，正确的酶活性单位定义如下：

酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

并非是自氧化速率到一半时的酶量。

过氧化物酶活性的测定与计算（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

一、原理

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料：马铃薯块茎。

（二）试剂

1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH7.0 （见附录）。磷酸氢二钠。。。。。磷酸二氢钠。。。。。

2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH7.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚（(邻甲氧基苯酚） 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

（三）仪器设备

分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。

三、实验步骤

1 ．称取植物材料1g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

四、结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。  过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ） ]=

把pH=7.0和pKa2=7.2代入，得c(H2PO4^-)=1.585*c(HPO4^2-)

磷酸盐浓度为0.01mol/L，就是c(H2PO4^-)+c(HPO4^2-)=0.01  这样可解出缓冲溶液中两种离子的浓度。

c(HPO4^2-) = 0.0039 mol/Lc(H2PO4-) =0.0061 mol/L

计算： n(P) = 0.01*1 =0.01 mol  m(NaH2PO4) = 0.01*120 =1.2g  NaH2PO4 + NaOH = Na2HPO4 + H2O m(NaOH) = 0.0039*1*40 = 0.156g

称取无水NaH2PO4 1.2克， NaOH 0.156克，加水溶解，再稀释至1 L即可。

纤维素酶活的活性检测方法

1. 纤维素CMC酶

1.0标题

用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围

生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理

纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂

4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖

4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器

5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备

6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）

溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂:

溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。

将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作：

7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。

7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作

纤维素酶的作用原理

1、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时,可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收熊谱成1996.

2、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌,补充内源酶的不足,并对内源酶进行调整,保证动物正常的消化吸收功能,起到防病,促生长的作用（张国立,1996）.

3、消除抗营养因子,促进生物健康生长.半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液,增加消化物的粘度,对内源酶造成障碍,而添加纤维素酶可降低粘度,增加内源酶的扩散,提高酶与养分接触面积,促进饲料的良好消化.

4、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物,在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物,从而使消化道内的消化作用得以顺利进行.也就是说纤维素酶除直接降解纤维素,促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外,还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化.

5、纤维素酶还具有维持小肠绒毛形态完整,促进营养物质吸收的功能.

脲酶试验原理：

存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。

试剂：1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液

标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。

1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。

2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟

3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并 仔细混合

4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h

5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。

6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。

7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。

8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。

结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。

M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10

式中：M－土壤脲酶活性值

X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数

100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值

10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值

注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时，本法能获得可靠结果。当脲酶活性小于3微克NH3-N，培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）

计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示。

NH3-N（mg）＝a*2

A：从标准曲线查得NH3-N毫克数

2 ：换算成1k土的系数。

答：本实验中用磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和 无机磷，其反应式如下： O || C6H6-O-P-ONa + H2O ≈ C6H6-OH + Na2HPO4 | ONa 由上式可见，当有足够量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。反应速率只在反应的最初一段时间范围内保持恒定。随着时间的延长，底物浓度的降低和产物浓度的升高，使逆反应加强。