乙醇引起的蛋白质变性与沉淀的结果与解释

盐析法——多用于各种蛋白质和酶的分离纯化

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析.常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等.各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离.例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性.调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好.盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等.针对温度这一条,需要强调：在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加.但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降.在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行.

使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用.另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH.

2.有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3)在生化制备中应用比盐析法广泛.但是,在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性.例如酒精消毒灭菌就是如此.因此,操作要求在低温下进行.有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

3.等电点沉淀法——此法单独应用较少,多与其它方法结合使用；

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时

蛋白质含量，离子强度，溶液pH值，乙醇浓度，溶液温度。

1。蛋白质含量，愈高，共沉多；反之，分离愈彻底。当然有度。溶液太稀了，成本高。

2。离子强度：这与介电强度有关。

3。溶液pH值：调到目标蛋白等电点周围。

4。乙醇浓度：一般来说乙醇浓度多少，与目标蛋白的分子量有关：比如8%，可沉淀纤维蛋白原，20%可沉淀球蛋白，40%可沉淀白蛋白等等，当然，乙醇浓度与溶液pH值配合使用。加入乙醇不能过快，防止局部过浓。要边加边摇动。 否则，共沉多！或者局部变性。

5。溶液温度：必须低温，乙醇反应是个放热反应，如果温度高，可引起蛋白质变性，不可逆的变形。

这五变参数，要综合，动态的调整，可达到精确分离蛋白质的作用。

蛋白质加酒精（又叫做乙醇）会发生变性现象，出现溶解度降低、黏度增加，生物活性丧失，易被蛋白酶水解，出现白色絮状沉淀。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。

蛋白质变性是指蛋白质分子中的酰氧原子核外电子受质子的影响向质子移动，相邻的碳原子核外电子向氧移动，相对裸露的碳原子核被亲核加成，使分子变大，流动性变差。酒精、尿素等化学物质可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。

扩展资料：

蛋白质加酒精的变性结果：

1、生物活性丧失：蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。

2、某些理化性质改变：蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

3、生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。

天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。

所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。

参考资料来源：百度百科-蛋白质变性

参考资料来源：百度百科-蛋白质的变性

在一定的酸性条件下，蛋白质颗粒都带有相同的电荷因而互相排斥，再加上蛋白质有一些亲水性的基团暴露在外面，因此可以在分子表面形成一层水膜，使得胶体颗粒更加稳定。这就是为什么蛋白质在一定的pH值可以溶解于盐酸中。

如果pH值接近此种蛋白质的等电点，此时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，蛋白质就会从胶体中析出。

蛋白质的空间结构发生变化，从而引起蛋白质理化性质和生物功能改变。

乙醇在医学方面可做为一种消毒剂，乙醇作用于细菌细胞首先起到脱水作用，乙醇分子进入到蛋白质分子的肽链环节，使蛋白质发生变性沉淀；这种作用在70%的含量下显得更强。乙醇可导致蛋白质分子间易形成氢键。

变性原因：

变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。

以上内容参考：百度百科-蛋白质变性

1.如果是醇溶蛋白,是不会有反应的,蛋白质不会沉淀.

如:醇溶谷蛋白

因为,这种蛋白质本身就是能溶解于醇的.因为醇,比如乙醇,其烃链属于疏水集团,而羟基属于亲水集团.蛋白质同样有疏水和亲水集团.因此,在蛋白质水溶液中加入醇.蛋白质亲水端与水相似相溶,而疏水端与醇相似相溶.因此,会形成稳定混合液体.

2.如果是不溶于醇的蛋白质,会发生变性而沉淀下来.

乙醇与水间氢键强于水溶性蛋白质与水间氢键.同时存在醇和水,醇会与蛋白质发生氢键作用,从而破坏蛋白质与水间氢键,造成蛋白质结构变化.从而fs了.

1、将蛋白质溶液和无水乙醇4摄氏度预冷；

2、调pH至目的蛋白的等电点（6.9）；

3、在磁力搅拌器的搅拌下缓缓加入冰冷的乙醇,乙醇终浓度为60%；

4、4℃静置30min后,离心、弃上清；

5、晾干沉淀、用pH8.0的Tris-HCl Buffer回溶.

问题是回溶时候十分难溶,即使好不容易将沉淀溶解了,溶液也是浑浊的,不澄清.请战友们分析一下会是什么原因啊? 大家在这里讨论一下乙醇沉淀的有关技术吧,谢谢啦!

以胶体形式分散在溶液中的蛋白,被乙醇破坏水化膜后而沉淀,部分蛋白可以复溶,这与具体的蛋白组分有关,也与你操作方式有关,如乙醇的浓度、温度、沉淀时间等.

沉淀不溶解并不是异常现象,我个人理解这正是实验所需要的,经过复溶后可以将不溶解的蛋白进行分离,这难道不是你要的结果吗?关键是你的目标蛋白是在那个组分中,如果是在不溶解组分中,可能需要调整你的实验方法,详细分析乙醇浓度与蛋白沉淀的关系.

回：shijs老师——

我在调节蛋白质溶液的等电点时发现蛋白质溶液的pH从8.0调至6.9的过程中,伴随着HCl的加入,有明显的沉淀产生,我想是不是这些沉淀导致了最后的回溶效果不好?于是我调完等电点之后,就把我的蛋白质溶液离心了,离心沉淀就是加酸过程中产生的沉淀,我将这些沉淀用Buffer回溶,发现的确是非常难溶,即使溶解了也是白茫茫的十分浑浊.难道是酸变性?有什麽办法解决之吗?