工业冰醋酸的 详细用途

制法:本品的工艺流程如下:

A组分:羧甲基纤维素+溶纤剂NT1+二

氯甲烷(15%)搅拌+润湿剂+甲酸+甲

醇+发泡剂PN(保温30°C)十苯酚(恒

温搅拌20min)

B组分:石蜡(85~95°℃)9降温至70~

80°℃+余量二氯甲烷,然后立即将B液倒

入A液→搅拌5min,即得成品。

冰醋酸蒸馏温度：16摄氏度。

一般情况下混合物的沸点低于混合物中任意一个组分的沸点，其熔点16 .6℃，沸点117 .9℃，什么温度合适跟其中混有的其他组分的量和其熔沸点有关，如果是水的话在100℃应该没问题，不过对于这些沸点稍高的物质建议回收时采用减压蒸馏。

乙酸二聚物

乙酸的晶体结构显示 ，分子间通过氢键结合为二聚体（亦称二缔结物），二聚体也存在于120℃的蒸汽状态。二聚体有较高的稳定性，已经通过冰点降低测定分子量法以及X光衍射证明了分子量较小的羧酸如甲酸、乙酸在固态及液态，甚至气态以二聚体形式存在。当乙酸与水溶和的时候，二聚体间的氢键会很快的断裂。其它的羧酸也有类似的二聚现象。

以上内容参考：百度百科-乙酸

最便宜的制备方式就是将醋酸和正丁醇混合，滴加催化量的浓硫酸，在100℃左右，在加装dean-stark装置的反应器中回流实现，最终产品需要通过精馏得到，其中副反应主要表现为正丁醇分子脱水，正丁醇的分子间脱水缩合，乙酸的分子间脱水等

1. 电泳法：根据核苷酸分子同时携带酸碱基团，在一定条件下，利用其在电场中的迁移速度不同而实现分离。

1) 纸电泳法： 将电场加在浸泡过缓冲液的滤纸上，使ATP与其他杂质分离，再利用比色法测定ATP的吸收值，计算其含量。此法是卫生部及地方采用的ATP标准检测方法。

2) 凝胶电泳法：根据介质不同，可分为聚丙烯酰胺电泳法（PAGE），SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳法，前两种方法常用于生物机制的研究。琼脂糖凝胶电泳法是以琼脂糖为介质，柠檬酸为缓冲液，利用电泳将ATP与杂质分离，实现ATP含量检测。

3) 毛细管电泳法：以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，利用各组分间淌度和分配行为上的差异，实现ATP与杂质的分离。

2. 光学分析法：因其操作简单、仪器要求低，常用于科研领域的ATP含量分析。

1) 分光光度法：采用ATP试剂盒，因ATP腺嘌呤碱基上存在共轭双键，在紫外下有吸收峰，可用紫外分光光度法检测ATP含量。

2) 生物发光法：利用荧光素在荧光素酶的作用下，与ATP发生反应，生成荧光素-ATP复合体，该复合体被分子氧氧化后激发荧光素发光，根据发光强弱可检测ATP含量。

3. 层析法：利用样品各组分之间亲和力、分配系数等化学性质的差异，实现ATP与其它杂质的分离。

1) 纸层析法：是检测核苷酸含量的常用方法之一。该方法常以异丙醇、浓氨水和水按7：1：2的混合作为展开剂。

2) 薄层层析法：该方法纸层析法原理基本相同，也是检测核苷酸含量的常用方法之一，其常用的展开剂是正丁醇、丙酮、冰乙酸、氨水、水按7：5：3：3：2的比例混合而成。

3) 离子交换色谱法：利用样品各组分离子交换能力或选择系数之间的差异，实现分离，常用于工业生产中ATP含量检测。

比移值 比移值〔Rf)：Rf＝a／b

a为斑点中心到原点的距离cm，b为溶剂前沿到原点的距离cm．Rf值最大等于1 ，最小等于0。Rf值是衡量各组分的分离情况的数值，Rf值相差越大，分离效果越好。

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3. 应用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分离

展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝4：1：2

显色：三茚酮

葡萄糖、麦芽糖和木糖混合糖类的分离

展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝4：1：5

作家原通求色认权改走信音矿备值存型。

显色：用硝酸银氨溶液喷洒，即出现Ag的褐色斑点。

定性：由Rf值可判断是哪种糖；葡萄糖的Rf为0.16，麦芽糖的Rf为0.11．木糖的Rf是0.28。

醋酸域醋酸酐)法

醋酸(或醋酸酐)法采用醋酸与过氧化氢反应,在酸的催化作用下,制得过氧乙酸.化学反应方程式如下：

CH3COOH+H2O2=CH3COOOH+H2O

若采用醋酸酐代替醋酸作乙酰化剂时,它与过氧化氢的化学反应式：

(CH3CO)2O+2 H2O2=2 CH3COOOH+H2O

但此反应过程中有大量热量产生,另外还可能生成二酰基过氧化物,有导致爆炸的危险,因此,从安全角度考虑,过氧化氢法合成过氧乙酸,仍以采用醋酸为好.

Seppo Pohjanvesi等对醋酸和双氧水连续化生产工艺进行了研究.研究发现,最佳的反应溶媒配比：双氧水质量含量为10%～20%、醋酸质量含量为15%～30%、过氧乙酸质量含量为5%～20%、硫酸质量含量为10%～20%和水质量含量为30%～50%,并加入质量含量0.1%～0.4%的稳定剂,温度一般为40～60℃.

林惠琼等考察过氧乙酸生产工艺中过氧化氢浓度、冰醋酸用量与不同稳定剂含量对产品稳定性的影响.结果发现,当原料过氧化氢含量为280、350、500 g/L时与双倍用量的冰醋酸反应,可分别生成最高浓度为157.5、192.0、292.0 g/L的过氧乙酸,过氧乙酸浓度越高,贮存稳定性越差,产品中加入1g/L8-羟基喹啉或0.1%磷酸,可明显提高过氧乙酸的稳定性.

王传虎等为研究过氧乙酸产品最佳配比和使用配制及储存条件,采用不同配比筛选和影响因素观察的方法,在实验室进行了实验观察.结果,乙酸与过氧化氢质量比为2：1时,催化剂硫酸用量在30～50g/L范围内,反应温度为25℃和反应时间为24 h综合条件下,产出过氧乙酸含量最高.影响因素观察发现,温度升高可促使过氧乙酸分解速度加快,配制使用浓度的过氧乙酸稀释用水以双蒸水最好,过氧乙酸产品中加入2 000 mg/L 8-羟基喹啉可明显提高过氧乙酸的稳定性.

郑晓兵等公开了一种过氧乙酸的生产方法专利.先将醋酸与27%浓度的双氧水按摩尔比1：1混合,并添加相当于反应物重量2%～5%的催化剂进行反应,催化剂采用3%浓度的苯磺酸或98%浓度的硫酸,反应温度为25～35℃,时间为1～3 h.然后采出水相,并收集过氧乙酸组分.本方法生产产品中过氧乙酸含量高,一般在50%以上,可通过加水配制成不同浓度,在各行业使用,原料醋酸利用率高,生产安全性好,且生产得到的产品中不含硫酸,过氧乙酸的含量可通过提高或降低塔效进行调节.

实验1总DNA提取

生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]

学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]

植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

[实验器材]

1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料

[实验试剂]

1、3×CTABbuffer（pH8.0）

100mMTris

25mMEDTA

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巯基乙醇

2、TE缓冲液（pH8.0）

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[实验步骤]

1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）

7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]

1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]

CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

液氮研磨的原理是什么？

实验二质粒DNA的提取

质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的`双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速

而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[实验器材]

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

5、Tip头、Eppendorg管

6、含有目的质粒的E.coli菌株

[实验试剂]

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6、EcoRI及其缓冲液

7、HindIII及其缓冲液

[实验步骤]

1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[注意事项]

操作时，避免剧烈震荡。

[思考题]

1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

2、SDS和NaOH的作用是什么？

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

实验三总RNA提取

【目的和要求】

1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。

2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。

3．了解RNA提取过程中的注意事项。

【实验原理】

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

【教学内容】

1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍

2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。

3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。

【实验器材和试剂】

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）

TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

【实验方法】

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴

中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3．加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.

5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.

6．4℃，离心12000r/min，15min.

7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。

8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。

（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂

TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：

1.匀浆处理（Homogenization）

（1）组织中提取总RNA

①植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。

②动物组织：按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。

（2）培养细胞中提取总RNA

①贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。

②悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。

（3）血液中提取总RNA

直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。

2．分层（PhaseSeparation）

（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。