苯酚-硫酸法测定多糖的原理

多糖样品含量一般为1.0ml。

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。

1、制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。

摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、取多糖样品1.0ml，加1.0ml蒸馏水，然后加入6%苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。

注意：

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

1、制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

2、对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

3、测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

扩展资料：

苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100ug范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。

苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

参考资料来源：百度百科-苯酚法测可溶性糖

参考资料来源：百度百科-苯酚-硫酸法

DNS 法为在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

苯酚硫酸法师利用糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物。在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。

此时，对于杂聚多糖，只用葡萄糖溶液做标准曲线，是不准的。有时用多种单糖标准品作标准曲线，但不同单糖标准品在相同浓度下其吸收值相差较大（葡萄糖显色最大），分别制作标准曲线对杂多糖测定的结果也就不同。因此，苯酚硫酸法对于成分复杂的多糖来说，只能是一个参考。

对杂多糖往往不用单一的苯酚硫酸法。比如，采用气相色谱法对杂多糖的组成进行分析，再配合苯酚硫酸法可以得到更可靠的结果，比单用苯酚 硫酸法更可靠、准确。

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C一标准方程求得糖量（ug）

α一吸取样品液体积（mL）

V－提取液量（mL）

n一稀释倍数

W一组织重量（g）

可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100

苯酚硫酸法测多糖。

是将多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖。

单糖中再加入苯酚反应（在强酸条件下）生成橙色衍生物。

在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

若要一起加入，先配成溶液的话。要先将苯酚溶于（温）水，然后将浓硫酸绶绶倒入。切不可将溶液注入水中。

说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色。颜色过深的话说明你的酚的浓度过大，一般是5%，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有肯能

。

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

1．

浓硫酸：分析纯，95.5%

2．

80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3．

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4．

标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5．

15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6．

5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7．

6mol/L

氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8．

6mol/L

盐酸