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在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。

一、标本的采集种类和要求

1、推荐采集的呼吸道标本种类

疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）

2、拭子的选择

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）

3、临床标本储存要求

保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

4、标本的分装处理

标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

5、标本的运输

疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。

二、核酸检测

基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。

1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：

4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。

2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：

目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。

三、病毒分离鉴定

可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。

四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全

（一）实验室级别及个人防护

1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。

2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。

（二）健康监测

1、所有人员均应自测发热及其他症状。

2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。

3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

五、附表和附件

附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单

附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单

附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）

附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）

附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒

附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法

附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡。

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量*

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3

real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程

中文翻译版（请同时参考英文原版）

请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)

本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。

一、概 述

（一）前提

本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。

（二）实验原理

实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan&reg探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。

（三）使用条件

一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。

（四）生物安全要求

样本处理应在相应的生物安全实验室完成。

（五）样本要求

1、呼吸道样本

支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。

2、排除标准

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本

2）以上未列的其它不当样本

（六）核酸提取

RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp&reg病毒RNA提取试剂盒，RNeasy&reg小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。

（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料

（一）试剂

1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；

2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；

3、正反向引物 (40μM)；

4、双重标记探针(10μM)；

5、阳性对照。

（二）供给

1、实验室标记笔；

2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；

3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；

4、0.2ml PCR 反应管盘；

5、光学反应盖板；

6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；

7、一次性无粉手套。

（三）仪器设备

1. 微量离心机；

2. 漩涡振荡器；

3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。

三、操作程序

（一）准备工作

1. 避免样品污染

由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：

1）实验准备与核酸提取使用独立区域；

2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；

3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；

4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；

5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。

2、仪器准备

工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY&reg”来减小核酸交叉污染的风险。

3、试剂准备

注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。

1）引物和探针

（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；

（2）涡旋振荡引物和探针；

（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。

2）Real time RT-PCR的试剂

（1）将Master Mix和酶置于冰架上；

（2）融化2×的Reaction Mix；

（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；

（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。

4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测

1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。

2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。

3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。

5、建立反应

反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。

1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；

2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：

* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。

5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；

6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；

7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：

实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。

8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。

9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。

10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。

11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；

12）将提取的核酸样本置于冰架上；

13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。

14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；

15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；

16）对剩下的样本，重复步骤13-15；

17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。

18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。

19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件

反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。

* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

7、解释说明/检验

1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。

2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：

（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；

（2）没有足够的人类细胞以备检测；

（3）方法建立和实施不当；

（4）试剂和仪器原因。

3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：

（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。

（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。

（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。

（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。

（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。

8、限制规定

1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。

2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。

3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

9、备注

引物和探针参见英文版P7。

附件4

real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程

（英文版）

附件5

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的

对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器

1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）

2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）

3、70%乙醇

4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）

5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）

6、检测引物

7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C

8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C

9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头

10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器

11、可调转速14K离心机：

12、旋涡混合器：

13、生物安全柜：二级生物安全柜

14、PCR仪：

15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685

16、核酸染料：

17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤

（一）RNA提取

1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。

3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。

7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。

（二）反应体系配制

1、实验设计：

检测标本RNA

质控参数：

阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）

阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

1）按下表加入试剂：

PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free Water

5×RT-PCR Buffer 11.9×n

5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反应

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR

扩增，反应程序如下： 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测

1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。

2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。

5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

5、结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下： PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒

非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒

送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

1．细胞中的物质组成

(1)有机物：一般含碳，如糖类、脂肪、蛋白质、核酸等，能燃烧。

(2)无机物：一般不含碳，如水、无机盐、氧气、二氧化碳(虽然含碳，但属无机物)。

2．细胞膜控制物质的进出

一般地说，细胞膜能让有用的物质进入细胞，把其他物质挡在细胞外面，同时，还能把细胞内部产生的废物排到细胞外。

3．细胞中能量的来源

4．多莉羊的诞生：多莉羊与提供细胞核的母羊一模一样，说明细胞核控制生物的遗传和发育。

5．细胞核中被染成深色的物质是染色体，它由蛋白质和DNA组成。DNA上具有遗传信息的片段叫基因。

6．细胞是物质、能量、信息的统一体。

(1)细胞的生活需要物质和能量。细胞膜能够控制物质的进出。叶绿体能将光能转化成化学能，并将化学能储存在有机物中。线粒体能够将有机物中的化学能释放出来，为细胞的生活提供动力。

(2)细胞中物质和能量的变化非常复杂，细胞的控制中心就是细胞核。

7．生物体由小长大与细胞的生长、分裂和分化是分不开的。

8．细胞的生长：结果是细胞的体积由小变大，细胞数量不变，遗传物质不变。

9．细胞的分裂：结果是一个细胞分裂成两个细胞，细胞数目增加，遗传物质不变。

(1)步骤

①细胞核由一个分成两个。

②细胞质分成两份，每份各含一个细胞核。

③在原来的细胞中央形成新的细胞膜，植物细胞还形成新的细胞壁。

(2)特点：细胞核分裂时，染色体的变化最明显，它先复制再均分，此时，产生的两个新细胞的染色体数量和形态相同，新细胞与原细胞的染色体数量和形态也相同。

10．细胞的分化：结果是形成不同的组织(细胞)，遗传物质不变。

在发育过程中，通过受精卵分裂出来的细胞在形态、结构上发生变化，使不同细胞具有不同的功能的过程。

11．单细胞生物：身体只由单个细胞构成。如细菌、酵母菌、草履虫、衣藻、眼虫、变形虫。

(1)草履虫的结构图

与运动有关的是纤毛；

与呼吸有关的是表膜；

与摄食有关的是口沟；

与消化有关的是食物泡；

与排泄有关的是表膜、收集管、伸缩泡；

与繁殖有关的是细胞核；

与排遗有关的是胞肛。

(2)单细胞生物与人类的关系：有的有益，有的有害。

12．细胞是完成生命活动结构和功能的基本单位：单细胞生物可以独立完成生命活动；多细胞生物按照一定的结构层次构成生物体，完成生命活动

分光光度计的简单原理

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

核酸的定量

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。

从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。

蛋白质的直接定量（UV法）

这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。

蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。

漂移的原因是因为 Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。

蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。

Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg /ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。

细菌细胞密度（OD 600）

实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。

分光光度计的重要配件 —— 比色杯

比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。

由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。

是利用其中的化学物质溶解毛发结构，以达到脱毛的目的。

含巯基的蛋自质未结合成双硫键时特别容易氧化，巯基通常是最活泼的蛋白质侧链，在碱溶液中容易失去硫原子，很容易与酰化剂、芳基化剂和烷基化剂反应，还能与芳基亚磺酰卤化物形成混合硫化物。

而巯基乙酸、巯基乙醇能拆开硫键生成相应的巯基化合物，在脱毛剂中作为增效剂使用的胍、脲等成份与蛋白质作用后能使蛋白质分子变成无规则、松散构象，从而使双硫与巯基乙酸等试剂充分得到接触。

扩展资料

化学脱毛剂分为无机脱毛剂和有机脱毛剂两大类。

常用的无机脱毛剂是钠、钾、钙、钡、锶等金属的碱性硫化物，但由于此类脱毛剂作用的ph较高（11-12左右），因此刺激性较大。

另外硫化物不稳定，易分解产生硫化氢逸去而降低其活性，同时还具有不愉快的气味，所以必须在这些物质中加入稳定剂。

常用的有机脱毛剂是巯基乙酸钙，是稍有硫化物臭味的白色结晶粉末，在水中的溶解度，常温下7%，96℃下27%，水溶液的ph值约为11，与无机脱毛剂相比，虽作用较慢，但对皮肤的刺激作用较缓和，几乎无臭味，加香容易。

注意事项

身体各个部位的皮肤敏感度是不同的。比如面部（尤其唇部）、阴部就是十分敏感的区域。因此，用在手臂上没问题的脱毛膏，未必意味着用在其他部位也没问题。

使用前必须做斑贴试验，斑贴试验的时候，一定要在多个部位都试验一次，以免发生意外。

参考资料来源：百度百科--脱毛膏

参考资料来源：百度百科--脱毛剂

PCR基本原理示意图（如右图）：

在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。 用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2 优于Mn2 ，而Ca2 无任何作用。

1．Mg2 浓度Mg2 的最佳浓度为1.5mmol/L（当各种dNTP浓度为200mmol/L时），但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg2 过量易生成非特异性扩增产物，Mg2 不足易使产量降低。

样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2 结合而降低Mg2 有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg2 的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2 浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2 的浓度。

2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。

3．KCl浓度K 浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。

5．二甲基亚砜（DMSO）在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。

决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA，而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度计定量。 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。

由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。

Cetus公司酶定义是：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。

分析条件为25nmol/L TAPS（三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3.25℃），50mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2.1mmol/L β-ME（巯基乙醇），dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP为100mmol/L(由不标记及α-32P标记混合)，12.μg变性鲱鱼精子DNA，最终体积50μl。 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA（如基因组的DNA时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如Sal1和Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng，0.1ng，0.001ng等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择，一般用1.5%～2%，电泳电压75V，待样品进行凝胶内距胶末端1cm时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。

由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng，其荧光强度与DNA含量成正比。

DNA分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照DNA分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析扩增的DNA片段。 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数

在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度比扩增引物的融解温度TTm低5℃，可按公式进行计算：

Ta = Tm -5℃= 4(G C) 2(A T)-5℃

其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。

4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。

扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。

二、引物引物设计

要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。

引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：

1．引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。

2．（G C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳。

3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。例如：

4．引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。

另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。

5．引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。

引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。

人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20℃冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存1～2年。

三、DNA聚合酶

在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。二是有’3’→5’外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力，它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985年Mullis 等发明了PCR方法，以Klenow片段完成β-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生活于60℃（B.Stearothermophilus）到87℃（S.Solfatavicus）的许多菌中分离纯化出耐热DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于PCR。

1．Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95℃的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：①Klenow酶的最适温度为37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1μg基因组DNA开始）而Taq酶为30个。③延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。

Taq酶由水栖高温菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃。最初从中分离到分子量60～68KDa，比活性为2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G C的30bp引物延伸，70℃时Kact>60nt/s；55℃可达24nt/s；37℃时为1.5nt/s，而22℃时低至0.25nt/s。高于90℃时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。

在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的时间分别为130、40及5～6min，在50次循环的PCR中当管内最高温度为95℃。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq 酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95℃。

Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。

Taq酶具有依赖DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5’-32P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为200μmol/L，Mg2 为1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性对测序有利。

2．影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2 离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2 为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%～50%。dNTP能与Mg2 结合，故游离Mg2 只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至4～6mmol/L时，Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl　PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。

用鲱精DNA，70℃，10min内dNTP的掺入量计算，标准条件为100%。

纯9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP浓度。但Taq酶具有DNA依赖的链移位5’→3’核酸外切酶活力。对5’→3’32P标记寡核苷酸单链，或与MB模板杂交时均只有极少的降解力。

中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%～60%，最佳KCl浓度为50mmol/L，浓度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。

加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或NaCl,可产生中度抑制或无作用。

低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS（0.01%及0.1%）的抑制作用。

3．第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5℃的半衰期从Taq DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR（Multiplex PCR）更为有利。

VentTMDNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100℃高温且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在104℃生长的Pyococcus菌GB-D株植入Deep Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半寿期达23h（Vent酶为6.7h,Taq酶为1h）。

4．RTth逆转录酶（rTth Reverse Transcriptase）目前逆转录-PCR（RT-PCR）的发展很快，所以对耐热的依赖于RNA的DNA多聚酶的研究也有进展。有实验表明Taq DNA多聚酶有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，但活性较弱。Cetus公司于1991年推出一种rTth Reverse Tran－scriptase,有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，二种活性分别依赖于Mn2 Mg2 ，这样就可分别控制酶活性。利用该酶只需250ng的总RNA即可有效地进行RT-PCR，得到特异的DNA片段，从而非常有利于逆转录PCR的发展。

耐热DNA聚合酶的研究得到长足的发展，这在PCR发展中起到了重要的作用。相信随着进一步的研究，将使人们对耐热DNA聚合酶的认识和应用更进一步地发展。

我国的PCR研究发展很快，其关键试剂-耐热DNA聚合酶-也已有几个实验室能够分离纯化，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院基础医学研究所。后二者的菌株为Thermus aquaticus YT-1。前者则是从自己筛选的嗜热菌中分离纯化，复旦大学遗传所亦已成功地克隆了该聚合酶的基因并获得了耐热F4DNA聚合酶，其酶学性质非常接近于Taq DNA聚合酶，为中国PCR的开展提供了保证。

四、影响PCR特异性的因素

通过上述内容。可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP 50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。

五、扩增平坡

扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平坡；进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：

1．底物过剩因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100μl反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1μg（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。

2．非特异性扩增产物的竞争与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。

3．退火时产物的单链自己缔合两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100μl时即可发生此现象，除稀释外无法克服。

4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。

总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。

动物细胞培养液：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆.

植物组织培养液的成分：水、无机盐、蔗糖、植物激素（生长素,细胞分裂素）等.

干细胞对培养条件要求较高,常用的胚胎肝细胞培养基有mTeSR

1培养基,主要成分有：DMEM、bFGF,EGF、血清、双抗、LIF、谷氨酰胺、二巯基乙醇、非必需氨基酸等。

干细胞相关的培养液都必须在5％CO2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。