亚硫酸盐处理的dna可以直接测序吗
普通的测序不能找到甲基化位点。 这里有几种常用的找甲基化位点的测序方法： 第一种是重亚硫酸盐测序。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
基甲基化检测主要几种：
甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCRMSP)
用亚硫酸氢盐处理基组DNA所未发甲基化胞嘧啶转化尿嘧啶甲基化胞嘧啶变；随设计针甲基化非甲基化序列引物进行PCR通电泳检测MSP扩增产物用针处理甲基化DNA链引物能扩增片段则说明该位点存甲基化；反说明检测位点存甲基化
2、亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCRBSP)
用亚硫酸氢盐处理基组DNA则未发甲基化胞嘧啶转化尿嘧啶甲基化胞嘧啶变随设计BSP引物进行PCR扩增程尿嘧啶全部转化胸腺嘧啶PCR产物进行测序判断CpG位点否发甲基化称BSP-直接测序PCR产物克隆至载体进行测序提高测序功率种称BSP-克隆测序
3、甲基化敏扩增态性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP利用DNA甲基化敏两种同裂酶Hpa IIMsp I基组DNA进行酶切连接由于两种酶能够识别相同限制性酶切位点即CCGG位点DNA序列CCGG位点现同程度甲基化状态别两种酶识别产物式体现
4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)
通准确定量单连续CpG 位点甲基化频率焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平细微改变序列延伸程根据CT掺入量定量确定单位点C-T比例同位点甲基化变异能准确检测由于焦磷酸测序提供真实序列数据甲基化状态序列形式呈现
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing： 即简化代表性重亚硫酸盐测序。该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理， 去除低CG含量DNA片段 ，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
甲基化数据处理流程：
简单来说，DNA甲基化就是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。
DNA甲基化测序
随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5’-甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，发现很多基因组学研究发现不了的东西，这就是 “DNA甲基化测序”！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。
目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS]、精准DNA甲基化和羟甲基化测序[oxBS-seq]、优化版简化甲基化测序[RRBS/dRRBS/XRBS]、单/微量细胞全基因组甲基化测序[scWGBS]、扩增子（羟）甲基化测序、（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序[(h)MeDIP-seq]等6种，适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案。
（1）全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
技术优势：
l 应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）
l 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究
①背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。
②方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究
③结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
（2）精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）
DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。
技术原理：
oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。
技术优势：
l DNA甲基化检测全新的“金标准”
l 全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰
l 多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率
l 实验偏好性低，重复性高（R²>0.98）
l 可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标区域氧化甲基化测序（Target-oxBS）
研究案例：
Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution （oxBS 技术单碱基检测5mC和5hmC在鼠胚胎干细胞中的水平）
①背景
随着5hmC在哺乳动物基因组中的发现，传统的bisulfite测序已不能精确区分5mC和5hmC的修饰差异，传统BS的测序结果中，5mC的修饰水平实际是5mC和5hmC两者信号的合集，建立一种精确区分两者的实验技术迫在眉睫。
②方法
利用oxBS测序技术对小鼠胚胎干细胞DNA甲基化和羟甲基化进行检测和定量。
③结论
本研究首次建立了通过化学氧化结合重亚硫酸盐处理的实验技术。该技术首先将5hmC氧化为5fC，进而可被重亚硫酸盐转换成U，从而排除了5hmC对5mC的信号干扰，达到精确检测基因组5mC的目的。运用该技术对小鼠胚胎干细胞的研究发现，5hmC在CGI相关的转录调控区域和LINE1元件中含量较高，表明其对表观重编程可能起到重要作用。
（3）简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析，我们开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
技术优势：
l 精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
l 重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。
l 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。
研究案例：
DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes DNA甲基化的改变对癌症细胞侵袭能力的影响
①背景
癌细胞的表型在一定程度上由表观决定，比如DNA甲基化。癌症发展后期的转移特性可能与表观遗传修饰的改变有关。
②方法
利用RRBS技术检测具有高侵袭性的非小细胞肺癌细胞系(A549和HTB56)以及相应经过甲基化抑制剂氮杂胞苷（azacytidine）处理过的细胞系的甲基化修饰。探讨甲基化的改变对肺癌细胞系的侵袭能力的影响。
③结论
高侵袭性细胞系在发展过程中，DNA甲基化修饰发生了广泛的改变。同低侵袭能力的细胞系相比，RRBS检测到的CpG富集的区域中有2.5%的区域发生了差异修饰。当使用了DNA甲基化抑制剂azacytidine，伴随着这些高甲基化修饰的位点出现甲基化修饰的丢失，细胞系的侵袭能力也发生了逆转。
5-Azacytidine诱导的侵袭能力逆转
（4）单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。
技术优势：
l 超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量
l 测序覆盖度高 ：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱
①背景
在哺乳动物基因组上，胞嘧啶（主要是CpG二连体中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示，DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要，如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活，以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示，精子和卵细胞结合受精之后，在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时，也在大量高度特异的DNA从头加甲基化，这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中，全局的DNA去甲基化‘净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。
②方法
利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法，首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析。
③结论
在这篇文章中，为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征，利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术，对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究，主要发现有：（a）首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。（b）首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转，在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显著高于父本基因组上的剩余甲基化水平。（c）首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。内容来源：易基因科技
CHEMetrics测量亚硫酸盐时采用滴定碘法,在这种方法中用酸溶液中的碘化物-碘酸盐滴定剂来滴定亚硫酸盐,用淀粉作指示剂。
亚硫酸盐一直被用作食品清洁和保存.亚硫酸盐作为一种抗氧化剂和抗菌剂,广泛地应用在酒类行业中.但是亚硫酸盐能引起过敏反应并导致气喘.所以,FDA和酒类,烟草,轻武器管理局都规定食品和饮料中的亚硫酸盐的浓度如果高于10ppm,那么一定要在商标上进行标注.CHEMetrics测量方法以Ripper法为基础,这种方法在酒类行业已经应用了许多年,已经成为了快速分析亚硫酸盐的标准方法.用碘化物-碘酸盐滴定剂来滴定亚硫酸盐,用淀粉作等当点指示剂.用磷酸来调节样品中的pH值.用能直接读数的滴定池来定量结果.游离亚硫酸盐的测量结果用ppm SO2表示。CHEMetrics的测量工具能用于白酒和红酒工业。测量方法能受到以下干扰:葡萄孢属,丹宁酸颜料,抗坏血酸维生素C等。
一代测序仪利用Sanger测序——双脱氧末端终止法的原理，将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这样的PCR产物与普通PCR不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。
1. 应用范围:
① De Novo测序
② 重测序: 如突变检测、SNPs、插入、缺失、克隆产物验证、比较基因组
③ 分型: 如微生物和真菌鉴定、HLA分型、病毒分型
④ 其它: 如甲基化分析（重亚硫酸盐测序）和SAGE（基因表达串联分析）方法
2. 临床应用
肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗
DNA胞嘧啶五碳甲基化(5mC)存在于各种生命体。可能因为它的基因组防御重要功能，所有已知的脊椎动物和陆生植物DNA都有这种修饰。5mC初始因各种重头甲基化转移酶(DNMTs)作用于非甲基化胞嘧啶而产生。在回文序列，如CG和CHG中，两条链的胞嘧啶都被甲基化。这种初始修饰形态在DNA复制过程中被维持甲基化酶“记住”，并对复制产生的半甲基化链发挥功能。哺乳动物DNA甲基化系统就是一个类似分工的例子。Dnmt 3a/b和Dnmt3L复合物行使重头甲基化功能，一但DNA甲基化在生殖细胞和胚胎发育过程中建立，Dnmt1酶将联合UHRF1进行维持。UHRF1可以识别H3K9me和半甲基化5mC的蛋白质。这种重头甲基化和维持甲基化的分工模式同样存在于陆生植物，尽管Dnmt3在被子植物中丢失且被其它酶替代。DNA甲基化对发育至关重要，在转座因子沉默、染色体稳定性、单等位基因表达和基因沉默等方面发挥关键作用。此外，Dnmt3a是急性髓性白血病常见的突变驱动基因，Dnmt3b突变导致常染色体隐性遗传病免疫缺陷、着丝粒区不稳定、面部异常等。
虽然后鞭毛生物基因组几乎都至少编码两种甲基化转移酶同系物，但个别物种只编码一个，人类病原真菌新型隐球菌就是其一，它是一种担子酵母菌类，在转座子富集的着丝粒和亚着丝粒区域具有对称的CG甲基化。该甲基化修饰依赖于 DMT5 基因编码的胞嘧啶甲基转移酶Dnmt5，该基因为新型隐球菌感染适应性所必须。Dnmt5蛋白家族的特征是具有一个N-末端染色质域（CD），其后依次为胞嘧啶甲基转移酶催化域、环指结构和SNF2型腺苷三磷酸酶（ATPase）相关的域组成（图1A）。这种推测甲基化转移酶在真菌和绿藻中广泛存在，其中一些物种CG甲基化已被证实可影响核小体定位。5mC在新型隐球菌中聚集在富含转座元件的重复序列上，这可能与真菌类隐球菌 Cryptococcus deuterogattii 发挥类似的转座子沉默功能。 DMT 5 基因失活突变伴随 Cryptococcus deuterogattii的5mC丢失。以下为作者探索 Cryptococcus neoformans 菌Dnmt5描述。
1.新型隐球菌5mC促进因子
已报到在新型隐球菌中，5mC修饰区域同时伴随H3K9me修饰。由此，作者通过将已纯化的含有CD结构域的片段与商业化集成人不同组蛋白修饰芯片结合，测试Dnmt5的CD结构域能否识别这一组蛋白修饰标记。结果H3K9me和H3K27me修饰肽均产生信号。然而，由于 C. neoformans 与人组蛋白H3的27位赖氨酸周围序列差异，作者进一步通过荧光偏振评估了染色质域与 C. neoformans 组蛋白H3序列的结合能力（图1B）。H3K9me的结合强度比H3K27me结合强度大幅增强显示H3K9me为CD的主要结合配体。
为进一步评估H3K9me是否影响5mC，作者敲除 C. neoformans 中H3K9仅有的甲基转移酶基因 Clr 4 ，用甲基化敏感酶（HpyCH4IV；AˆCGT）消化基因组DNA，然后Southern杂交测定5mC。基于已发表的野生型新型隐球菌5mC图谱，作者设计了一个唯一识别着丝粒13的特异性探针（probe U）（图1C）。此外，还设计了另一个识别重复着丝粒序列的探针（probe R），实现一次性分析多个着丝粒5mC位点的分布。在探针检测区域， clr 4 敲除（ clr 4 Δ ）菌株的5mC水平显著降低，而dmt5敲除（ dmt 5 Δ ）菌株或DNMT催化结构域或ATPase结构域催化残基突变的菌株没有产生5mC修饰（图1D）。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析FLAG-Dnmt5发现其募集到H3K9me结构域显著减少。相反，Dnmt5染色质域的一个废除其结合H3K9me（ W 87 A ， Y 90 A ）的突变对5mC的影响很小，这表明存在其它H3K9me依赖性因子影响5mC水平（图1E）。异染色质蛋白1（HP1）家族包括多种保守蛋白，可通过与H3K9me结合，参与异染色质形成，并促使5mC甲基化。在 C. neoformans 中，作者根据裂殖酵母同源基因特征，鉴定了一个HP1种间同源基因，命名为 Swi 6 。虽然swi6敲除对5mC影响较轻，但 swi 6 敲除和 dmt 5- W 87 A ， Y 90 A 共突变比clr4敲除降低了5mC的水平（图1E）。免疫沉淀结合质谱和免疫共沉淀检测显示Swi6和Dnmt5物理结合，表明H3K9me通过Dnmt5的CD结构域和HP1蛋白两种方式招募Dnmt5促使5mC形成。
缺失H3K9me的细胞仍残留5mC让作者进一步探索DNA甲基化的其它相关因子。 C. neoformans 具有一种类似于Uhrf1的蛋白质，该蛋白质包含SRA结构域（图1F），但缺失人种间同源基因的H3K9me读取Tudor结构域和RING E3连接酶结构域。运用非变性凝胶电泳，作者检测了 C. neoformans 重组Uhrf1与6个CG位点分别进行无甲基化、半甲基化和对称甲基化标记的DNA结合的能力。结果显示Uhrf1选择性地结合半甲基化DNA（图1F）。Uhrf1（ uhf 1 敲除）缺失对体内5mC的影响几乎检测不到，但当与Clr4共缺失（ clr 4 敲除加 uhf1 敲除）时，捕获的5mC分布略有改变（图1G）。
为了在全基因组范围内分析这些基因型，作者通过全基因组甲基化测序检测了野生型、 dmt 5 敲除、 clr 4 敲除 、 uhf 1 敲除和 clr 4 及 uhf 1 共敲除菌株DNA甲基化分布（图1H）。对比 clr 4 缺失， clr 4 和 uhf 1 双缺失菌株DNA的CG二核苷酸对称甲基化从31%减少到11%（图1I和1J）。分析表明，Uhrf1和Clr4通过两条平行的途径促使了5mC的形成（图1J）。
2.纯化的Dnmt5显示出精确的维持甲基化的特异性
在 C. neoformans 中，Dnmt5与Uhrf1同系物行使功能，并可以独自识别H3K9me，这种特征让作者联想到哺乳动物甲基化系统的维持。作者因此检测Dnmt5是否具有维持酶期望的底物特异性。通过酿酒酵母表达并纯化全长Dnmt5。通过S-[3H-甲基]-腺苷甲硫氨酸供体和合成的20bp双链DNA寡核苷酸底物进行甲基转移酶分析，这些底物含有6个CG位点，进行未甲基化，半甲基化，或者所有CG位点对称甲基化修饰。与缺乏Dnmt5的对照相比，在ATP缺失情况下，Dnmt5对任何底物未显示活性（图2A）。然而，在ATP存在条件下，与人Dnmt1催化速率相当，Dnmt5仅对半甲基化底物表现活性（图2A和2B）。此外，不管胞嘧啶甲基化状态如何，Dnmt5对CHG序列未表现出像对CG序列的活性，表明Dnmt5酶的CG二核苷酸特异性。
由于Dnmt5染色质域识别H3K9me，作者通过体外引入H3K9Me3肽分析是否存在重头甲基化活性。在甲基化或无甲基化修饰H3K9肽的形况下，半甲基化底物的比率相当，且对非甲基化DNA底物没有影响（图2C和2D）。作者进一步测试是否重组Uhrf1和Swi6可以触发重头甲基化活性，但并未发现。作者因此得出结论，Dnmt5是一种在体外作用于半甲基化底物的维持酶，对非甲基化底物没有活性。
3. 5mC在机体内通过维持机制而繁殖
尽管Dnmt5在体外显示了维持酶的底物专一性，但在体内它与其它因子共同作用可能改变其性质。分析这个问题的一个方法是从细胞中去除Dnmt5，让甲基化丢失，然后重新引入这个酶。如果Dnmt5在细胞中起维持酶的作用，那么DNA甲基化将不能在基因组范围内被重新恢复，因为它的半甲基化底物已经丢失。
作者首先构建了半乳糖诱导启动子控制Dnmt5基因表达， pGAL-DMT5 （图3A），该等位基因N末端进行2XFLAG标签表位标记。通过对葡萄糖抑制的20（I20）或45（I45）代筛选菌株诱导表达Dnmt5蛋白，作者通过Southern杂交未检测到5mC，而构建的Dnmt5表达显著（图3A）。为了评估 pGAL - DMT 5 等位基因是否起作用，靶向构建物进而转化野生细胞，并运用诱导 pGAL7 进行筛选（图3B）。诱导条件下I0代菌株与野生型菌株的5mC无可辨差异，表明可诱导的标记的等位基因是发挥功能的。随后，抑制 pGAL - DMT 5 ，5mC丢失。进一步再次诱导40（I40）或90（I90）代菌株的Dnmt5，未能检测到5mC。为确认细胞仅部分去除5mC后，如通过核形成传播机制（nucleation-spread），甲基化修饰能否被恢复，作者建立了抑制 pGAL-DMT5 有限代数后（R）再诱导（I）的时序实验。在抑制条件下，25代后5mC大幅降低。然而，当转移到含半乳糖诱导培养基后，作者未观察到5mC的恢复（图3C和3D）。
作者进一步运用不同方法进行了类似的分析。首先敲除部分 DMT 5 基因，再重新引入缺失DNA序列（图4），重新引入的等位基因称为 RI-DMT5 。尽管 RI - DMT 5 的表达与野生型相当，但Southern杂交检测不到5mC（图4A）。 Dmt 5 敲除菌株全基因组甲基化测序显示所有CG位点无甲基化修饰（图4B）。对两株 RI - dmt 5 菌株测序发现，除了两个位点外，5mC在全基因组范围缺失（图4B）。进一步通过液相色谱-质谱对从野生型、 dmt 5 Δ 和 RI - DMT 5 基因组DNA分析，结果显示野生型gDNA中5mC（5mC/dG）为0.33%， dmt 5 Δ 未检测到， RI-DMT 5 菌株为痕量（可检测但低于量化限值）（图4C）。这种痕量活性表明，Dnmt5对未修饰DNA的活性可能非常低，并来源于维持酶活性的记忆。
H3K9me组蛋白修饰在 dmt 5 Δ 和 RI - DMT 5 菌株仍然全基因组分布，尽管与野生型相比分布有所改变，且在子端粒区域信号变强（图4D）。此外，ChIP-seq测序证明RI-Dnmt5蛋白仍旧定位在异染色质区域（图4E）。
为了明确 RI - DMT 5 是否能够有效地维持DNA甲基化，一种着丝粒13被耐药标记（CEN13：：natR）的野生型菌株，其与 RI-DMT5 菌株杂交（图4F）。从杂交后代筛选出具有 RI - DMT 5 等位基因和着丝粒标记的减数分裂后代。 CEN 13 特异性探针进行Southern杂交检测其5mC。所有子代都呈现野生型5mC模式（图4F）表明 RI - DMT 5 等位基因可在存在甲基化底物条件下发挥功能。
许多物种需要一种或多种重头甲基化酶通过有性生殖建立5mC。有研究称，串联重复 URA 5 标记的转基因在 C.
neoformans交配和减数分裂/产孢后，因RNA干扰而非DNA甲基化形成可遗传性沉默。尽管如此，为了确定非甲基化着丝粒经有性生殖能否发生甲基化修饰，作者通过两种遗传杂交分析减数分裂后代。在对照组，将 CEN 13:: natR 菌株与 dmt 5 D 菌株杂交，运用 CEN 13 特异探针和Southern杂交分析同时包含 CEN 13 标记和野生型 DMT 5 等位基因的三个子代。如预期的那样，子代甲基化在5mC修饰的着丝粒上得以维持（图4G）。在实验组，将野生型菌株与含有 dmt 5 Δ 等位基因缺失且同时携带 CEN 13:: natR 的菌株杂交，同样分析了表达野生型 DMT 5 等位基因和标记着丝粒的三个子代，它们是以非甲基化状态进入杂交的。结果显示子代仍然没有发生甲基化修饰，这表明Dnmt5能够维持甲基化，但是不能在完全失去甲基化的着丝粒上重新建立（图4H）。因此，有性生殖并不能有效恢复5mC。最后，作者将细胞置于多种应激条件下，确定 RI - DMT 5 菌株能否重建甲基化，结果并未发现。
为评估Dnmt5甲基化维持特异性是否依赖于内源序列特性，作者通过HpaII甲基转移酶（产生对称的CmCGG）体外构建了一个富含HpaII位点的DNA甲基化片段，并将其整合到 C. neoformans 着丝粒4右侧边界的基因组中，以使其接近H3K9me修饰的染色质（图5A-5C）。转化株DNA经5mC敏感性HpaII限制性内切酶消化，通过酶切位点两侧设计引物，qPCR分析甲基化相对水平（图5D）。结果显示除了CG二核苷酸特异性外，体内似乎没有维持甲基化的序列特异性要求，这与生化结果一致。
接下来作者通过体外甲基化位点作为成核位点（nucleation sites）来检测5mC是否能在体内扩展。运用5mC敏感酶BstUI（CGCG）和Hpy99I（CGWCG）切割基因组DNA，并对这些位点进行qPCR分析。结果未观察到高于背景以上的任何信号，这表明5mC修饰未扩散到临近的CG二核苷酸上（图5E）。体外观察到类似的结果：作者将纯化的Dnmt5与不含CG位点、两个未甲基化CG位点或两个未甲基化CG位点且伴有一个对称甲基化CG位点的双链DNA底物孵育（图5F）。虽然在与细菌DMT M.SssI孵育的对照产物检测到甲基化产物，但与Dnmt5孵育的产物没有检测到甲基化信号，这表明即使存在临近甲基化位点，该酶也无重头甲基化活性（图5F）。
4.祖先物种重头甲基化酶基因丢失
鉴于Dnmt5是 C. neoformans 基因组预测的唯一的甲基转移酶，并且似乎起甲基化维持作用，那5mC是如何建立的？为了探索这一问题，作者研究 C. neoformans 属生物家族——银耳科( Tremellaceae )基因组。与 C. neoformans 基因组密切相关的物种包括人类致病菌 Cryptococcus gattii 和非致病菌 Cryptococcus
amylolentus和 Cryptococcus wingfieldii ，仅含一个预测的与Dnmt5是同源的DNA甲基转移酶（图6A）。 C. deuterogattii 所有转座子失活并失去RNAi和5mC。另一个最接近的物种， Cryptococcus
depauperatus，缺乏预测的DNA甲基转移酶，同样暗含 DMT5 在其进化过程中丢失（图6A）。值得注意的是，较远物种同时编码Dnmt5和一种未知的预测性DNA甲基转移酶，称为DnmtX（基因座位： DMX 1 ）（图6A）。该预测蛋白包含一个溴相关同源（BAH）域和一个Dnmt催化结构域。系统发育模式显示 DMX 1 基因在 C. neoformans 和 C. depauperatus 的共同祖先中丢失，并且 C. depauperatus 后续同时丢失了 DMT 5 基因。由于Dnmt5是一种维持性甲基化酶，作者提出DnmtX是一种重头甲基转移酶的设想。
作者分别从 Kwoniella mangroviensis, Kwoniella bestiolae和 Kwoniella pini 中克隆DnmtX基因进行假设验证。克隆基因分别插入pGAL7半乳糖诱导启动子且N末端进行血球凝集素表位标签标记。随后将其转基因到 C. neoformans 菌株，且 C. neoformans 菌株先前通过基因改造，包括破坏Dnmt5基因，然后通过FLAG标记的等位基因（ RI - DMT 5 ）修复。之所以选用该技术是基于作者认为DnmtX酶可能难以有效生成5mC，特别是重头甲基化相关的重要辅酶因子没有被引入。
因为所预测用DnmtX酶建立5mC可能是低效的，特别是在没有引入对新甲基化重要的辅助因子的情况下。
含有半乳糖的培养基诱导每个菌株表达DnmtX，然后提取DNA。采用甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）和全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）两种技术进行全基因组5mC水平检测。两种检测技术在三种菌株中都观察到广泛的积累了5mC，主要集中在着丝粒区域（图6B）。这些数据表明，三种DnmtXs在体内都为重头甲基化转移酶，证明了祖先DnmtX也具有这种功能。
5.实验演化揭示维持5mC的保守性
祖先DnmtX基因丢失发生在 C. neoformans 和 C. depauperatus 分化之前，T remella mesenterica 和 Kwoniella heveanensis 分化之后（图6A）。 C. neoformans 和 C. gattii 分化时间预计在34至49 百万年前。鉴于系统发育关系， C. neoformans 和 C. depauperatus 的分化时间要更为远古。 C. neoformans 和 T. mesenterica 的共同祖先预计生活在153百万年前。因此， DMX 1 基因可能在150到50百万年前期间丢失。综上所述，这些数据表明，Dnmt5在相当长的时间内维持了5mC，致使致病性 Cryptococcus 种群的形成。
为了解5mC是如何自DnmtX远古消失以来进行持续的，作者对 C. neoformans 进行演化实验。野生型（第0代或g0代）单菌落在充足的液体培养基中繁殖120代，无菌落瓶颈。培养液稀释后涂布琼脂糖平板，形成单菌落。挑取两个独立克隆，同时对其亲代分别进行全基因组亚硫酸盐测序，进行重复性实验（图6C）。对比亲代分别检测到50个和38个甲基化位点丢失（图6D和图6E），表明99.0%和99.2%的5mC位点在120代得以维持。两个克隆共同丢失的甲基化位点只有两个，应该为偶然发生的重叠（图6E）。假设所有位点同等维持甲基化信息，并为一阶动力学，那么单个5mC位点每一代的丢失率为9.3 X 10-5。与重复性实验一致，作者在每个实验中观察到新增5个甲基化位点（图6E）。通过未甲基化位点评估，每一代甲基化位点实际获得的概率为4.5*10-6。
6.进化分析揭示5mC甲基化图谱的保守型
作者首先试图比对具有四个明显分化枝，VNI、VNII、VNBI和VNBII，共同享有约4.7百万年前祖先的分化菌的着丝粒区域（图7A）。由于甲基化富集区着丝粒含有包括 gypsy 和 copia 的逆转录转座子Tcn1-Tcn6 六个家族，数百个菌株的短读长测序数据仍无法组装。进一步作者通过牛津Nanopore（ONT）对四个分化枝的各两个分离株进行几乎全长测序（图7B）。着丝粒点阵图分析显示序列存在广泛的重排（插入、缺失、倒置），排除了端到端多序列比对。作者通过对八个组装基因组着丝粒片段间的局部比对实现一系列双端比对序列。这些菌株平均88.5%的着丝粒区域至少比对到另外一种菌株的同源着丝粒，序列中位数比对长度在607bp。对每一菌株重复性实验的全基因组甲基化数据分析，并将数据与组装序列进行关联。图7C展示了其中A1-35-8(红色片段)的 CEN4 与其它七个分离株(蓝色片段)着丝粒双比对序列关系，结果显示CG位点的5mC状态可以在任意选取菌株（A1-35-8）的着丝粒和其它七个菌株同源着丝粒的甲基化状态相关联。接下来，对于每一个菌株中的每一个着丝粒CG位点，确定对于给定CG位点能够通过比对鉴定到的菌株数量（N），然后计算甲基化CG位点在所有菌株N中的比例(图7D)。数据统计显示，与空白模型对照相比，不论作为参照菌株，还是着丝粒CG二核苷酸能够比对到的菌株数量，共享甲基化位点增量显著。
由于 C. deuterogattii 伴有5mC丢失和完整转座子，因此可能如前所述，DNA甲基化主要发生在Tcn元件。作者进一步检测这些元件与无Tcn着丝粒序列相比，5mC的水平是否表现较高，并且甲基化图谱是否保守。在所有八个菌株中，作者鉴定了着丝粒区域与Tcn1-Tcn6高度同源的序列，包括一个包含两个LTRs的片段，将其作为候选活跃转座子。由于其序列长度以及重复性的特征，全基因组甲基化数据无法很好的覆盖Tcn元件，因此借用Nanopore长读长数据的甲基化信息对全基因组甲基化数据进行补充，且发现与全基因组甲基化数据高度一致。跟关注的Tcn元件甲基化活性相一致，作者发现着丝粒上Tcn相关序列CG甲基化比例远高于非Tcn相关序列(图7E)。
因为发现Tcn3相关序列呈现最长的中位数长度和最多的LTR侧翼元件，因此对其进行深入分析。将最长的Tcn3相关序列（上四分位数）的每一个CG二核苷酸与5mC数据比对。对于绝大部分比对的CG二核苷酸（图7F，垂直列），相对于独自5mC位点次序改变的Tcn3对照模型，共享甲基化比例更高（平均分数0.7对0.4149，p<10-16），表明菌株间5mC模式共享高于期望值。同时注意到，在一些情况下，单个菌株内不同Tcn3元件的甲基化模式相似（图7F），这更可能是重组的结果而非逆转录转座，因为后者通常认为是去除甲基化模式。小部分几乎无甲基化修饰的Tcn3可能在某个点上经历过逆转录转座而因此消除5mC，也可能是一些不再起作用的失活元件。
参考文献：
1.Catania et al., Evolutionary Persistence of DNA Methylation forMillions of Years after Ancient Loss of a De Novo Methyltransferase, Cell(2020).
2. Du,J., Johnson, L.M., Jacobsen,S.E., and Patel,D.J. (2015). DNA methylation pathways and their crosstalk withhistone methylation. Nat. Rev. Mol.CellBiol.16, 519–532.
3. Jones, P.A. (2012). Functions of DNA methylation:islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat. Rev. Genet. 13, 484–492.
4.Simpson, J.T., Workman, R.E., Zuzarte, P.C.,David, M., Dursi, L.J., and Timp, W. (2017). Detecting DNA cytosinemethylation using nanopore sequencing. Nat. Methods 14, 407–410.
表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。
全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。
全基因组甲基化测序原理示意图入下：
样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检
（一）样品检测
对DNA样品的检测主要包括2种方法：
（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰；
Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。
（二）文库构建
样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。
（三）文库质检
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>2nM），以保证文库质量。
（四）上机测序
文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。
（一）原始下机数据质控
原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：
原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。
（二）序列比对
经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：
（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。
（2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。
（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。
利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。
（三）甲基化水平计算
甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：
Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%
其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：
利用BSMAP统计甲基化水平。
（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计
DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：
本分析检测DMR的标准如下：
（1）区域平均甲基化差异不小于0.1；
（2）CpG位点数不少于5个；
（3）区域长度不小于50 bp；
（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于0.05；
（5）2D KS-test检验P值小于0.05。
（五）信息分析流程示意图
DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。
首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究
1、背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。
2、方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究
3、结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
以上就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。
参考文献：
[1] Ashburner, M. and C. A. Ball, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet, 2000, 25 (1): 25-9.
[2] Dirk Schübeler. Function and information content of DNA methylation. Nature, 2015, 517: 321–326.
[3] Frank Jühling et al. metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data. Genome Research, 2016, 26: 256-262.
[4] Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30.
[5] Tadafumi Kato Kazuya Iwamoto. Comprehensive DNA methylation and hydroxymethylation analysis in the human brain and its implication in mental disorders. Neuropharmacology, 2014, 80: 133-139.
[6] Xiaojing Yang et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer. Cancer Cell 26, 577–590.
[7] Yuanxin Xi et al. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program. BMC Bioinformatics, 2009, 10:232.
[8] Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr27(4):526-539. pii: cr201725.
