硫酸苯酚法测多糖有什么要特别注意吗

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。

1、制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1。8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。

摇匀静置30分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2、取多糖样品1.0ml，加1.0ml蒸馏水，然后加入6%苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，在涡旋仪上震荡，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。

注意

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1—0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

这两个方法差不多，哪个方便或者误差小就用哪个。

再有就是苯酚硫酸法中使用的苯酚必须重蒸，这个挺不好弄的，也有点危险，所以自己看着办。

（一）苯酚法测定可溶性糖

【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。

（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。

（3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C一标准方程求得糖量（ug）

α一吸取样品液体积（mL）

V－提取液量（mL）

n一稀释倍数

W一组织重量（g）

（二） 蒽酮法测定可溶性糖

【实验原理】

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。

【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。

（2）浓硫酸（比重1.84）

【实验步骤】

1．标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。

2．可溶性糖的提取同方法一第二步。

3．显色测定：吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。

4．计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。

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苯酚加入浓硫酸发生磺化反应，生成苯磺酸或苯酚二磺酸，具体根据化学反应条件的不同生成不同的产物。

向有机化合物分子中引入磺酸基团的反应称为磺化反应。磺化反应是指硫原子与碳原子相连的反应，得到的是磺酸化合物。磺化是放热反应，低温磺化时需要冷却，而高温磺化则需要加热保温。 芳香族化合物主要用直接磺化，即亲电取代反应。

扩展资料

苯酚类的芳烃磺化反应：

1、芳烃的磺化反应通常采用浓硫酸或含有5%-20%三氧化硫的发烟硫酸。磺化反应是一种可逆反应，欲得良好产率的磺酸，必须使用过量的磺化剂或者不断移去生成的水。

2、对于较难磺化的芳烃可采用三氟化硼，锰盐，汞盐，矾盐做催化剂。由于磺化反应是一可逆反应，磺酸基位置随反应。

3、磺化反应的可逆性的一个重要应用是将磺酸基先临时占据芳环某特定位置，然后再进行其他的反应，待反应完成后，再在稀硫酸中加热，以移去磺酸基。

参考资料来源：百度百科-苯酚

百度百科-磺化反应