测定苯酚的方法

方法提要

在酸性条件下，用GDX-502固相萃取柱吸附水中酚类化合物，乙腈解析柱中有机酚，高效液相色谱-紫外检测器检测。

方法适用于饮用水、地下水及湖库水中苯酚、对硝基酚、间甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚6种酚类的测定。对水中6种酚通常可检测到10～50ng/L水平。

仪器

高效液相色谱仪带紫外检测器，恒流梯度泵系统。

色谱柱WatersSymmetryC8，4.6mm×250mm，粒径5μm或性质相似的色谱柱。

GDX-502固相萃取小柱将使用过的SPE小柱填充物去掉并清洗干净，湿法加入约为0.5g纯化溶胀后的GDX-502树脂，打开活塞放出甲醇，直到液面刚好达到树脂床顶部。用10mL乙腈淋洗树脂，再用10mL水淋洗树脂，每次淋洗保持液面不低于树脂床。

针头过滤器孔径0.45μm，直径13mm，有机系。

固相萃取装置12管固相萃取装置。

真空泵。

采样瓶1L具磨口玻璃塞的棕色玻璃细口瓶。

氮吹仪。

微量注射器10μL、50μL、100μL、1000μL等气密性微量注射器。

K.D浓缩瓶25mL，带1mL定量管，须标定容积后使用。

试剂

空白试剂水去离子水蒸馏再经Millipore处理。

高效液相色谱流动相为水(含1%乙酸)和乙腈的混合溶液。

碳酸氢钠溶液c(NaHCO3)=0.05mol/L。

硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。

乙腈，甲醇HPLC级。

丙酮(C3H6O)农残级。

乙酸。

盐酸。

标准储备溶液苯酚、对硝基酚、间甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚六种的混标，购自国家标准物质研究中心。保存在-18℃冰箱中。

GDX-502树脂使用前用丙酮浸泡数日，数次更换新溶剂到丙酮无色。再用乙腈回流提取6h以上。纯化后的树脂密封保存在甲醇中备用。

替代物标准2-氟苯酚和2，4，6-三溴苯酚混标。

样品的采集与保存

1)水样采集。必须采集在玻璃容器中，在采样点采样及盖好瓶塞时，样品瓶要完全注满，不留空气。若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸钠除氯。

2)水样保存。避光、4℃下中保存。采样后7d内完成提取。40d内完成分析。

分析步骤

1)水样预处理。用孔径0.45μm的玻璃纤维滤膜，去除水中机械杂质。根据水中酚类化合物含量，取水样50～1000mL，加入2-氟苯酚和2，4，6-三溴苯酚等替代物标准，用6mol/LHCl调至pH2。水样以10mL/min的流速流经已活化的GDX-502固相萃取柱。当水样完全流过柱子后，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液10mL淋洗柱子。用N2或空气将柱中水分充分抽干。用4mL每次1mL乙腈淋洗小柱，前两次淋洗液需在柱中平衡10min，后两次平衡2min，合并淋洗液，最终用乙腈定容为1.00mL。0.45μm有机相滤膜过滤，HPLC分析。

2)校准曲线。

3)高效液相色谱分析条件。

紫外检测器:双波长检测，检测波长280nm和290nm。柱温35℃。

流动相组成:A泵，99%水+(1+99)乙酸B泵，100%乙腈。

流动相流量:1mL/min，恒流。梯度洗脱，洗脱程序，见表82.41。

表82.41 洗脱程序

4)色谱图的考察。见图82.13。

定性与定量分析

1)定性分析。以样品保留时间和标样保留时间相比较来定性。根据标准色谱图各组分的保留时间，确定出被测样品中目标物数目和名称。对有检出的样品需用其他方法确证，如GC-MS等技术。

图82.13 六种标准酚类样品在不同检测波长下的液相色谱图(2μg/mL)

2) 定量分析。每个工作日必须测定一种或几种浓度的标准溶液来检验校准曲线或响应因子。如若某一化合物的响应值与预期值间的偏差大于 10%，则必须用新的标准对该化合物绘制新的校准曲线或求出新的响应因子。使用紫外检测器时，6 种酚类的最大吸收波长不同，为提高分析灵敏度，苯酚、间甲酚采用 280nm 波长定量对硝基酚、2，4 -二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚采用 290nm 波长定量。计算公式参见式 (82.16) 。

方法性能指标

1) 精密度、检出限和线性范围。按实验方法，配制浓度为 0.5μg / mL 酚类混合标准样品，按选定的工作条件分析，重复检测 7 次，计算方法的精密度。检出限的测量是以相对于基线噪音 3 倍时组分峰高所对应的浓度。各组分的精密度、检测下限和线性范围见表82.42。

表82.42 方法精密度、检出限及线性范围

2) 准确度。分别将 50μL 浓度为 2μg / mL 的混合标准样品加入 0.25L 和 1.0L 试剂空白水中，用 502 树脂固相萃取柱吸附富集，洗脱后定容 1.0mL，HPLC 测定，计算加标回收率。结果见表82.43。

表82.43 方法的准确度

3) 基体加标回收率。从北京不同地区取护城河水过滤后，分别取 1L 水加入表82.44中不同量的标准样品，及未加入标准样品的 1L 水，经水样预处理，在 HPLC 上检测，得到加标回收率。

表82.44 地表污水加标回收率

注: 2-氟苯酚、2，4，6-三溴苯酚为替代物，回收率均符合控制限要求。

微量水分测定仪原理：

试剂溶液是由占优势的碘和充有二氧化硫的吡啶、甲醇等混合而成。卡尔--菲休试剂同水的反应原理是：基于有水时，碘被二氧化硫还原，在吡啶和甲醇存在的情况下，生成氢碘酸吡啶和甲基硫酸氢吡啶。反应式为：

H20+I2+SO2+3C5H5N → 2C5H5N·HI+C5H5N·SO3 …………(1)

C5H5N·SO3+CH3OH  → C5H5N·HSO4CH3  …………………(2)

在电解过程中,电极反应如下：

阳极：2I- - 2e → I2  …………………………………(3)

阴极：2H+ + 2e → H2↑…………………………………(4)

阳极产生的碘又与水反应生成氢碘酸，直至全部水分反应完毕为止，反应终点用一对铂电极所组成的检测单元指示。依据法拉第电解定律可知, 参加反应的碘的分子数等于水的分子数，同电荷量成正比例关系。水量与电荷量有如下等式成立：

W=Q/10.722  ……………………………………………（5）

式中：W -- 样品中水分含量        单位：微克

Q -- 电解电量              单位：毫库仑

微量水分测定仪应用行业：

用于食品、生物、制药、化工、纺织、造纸、包装、环保、气体等行业中

1.2掌握应用紫外分光光度计进行定量分析的方法和基本操作。

2、实验原理

苯酚是工业废水中的一种有害物质，如果流入江河，会使水质受到污染，因此在检测饮用水的卫生质量时，需对水中酚含量进行测定。

苯具有环状共轭体系，由 π→π*跃迁在紫外吸收光区产生三个特征吸收带：强度较高的E1带，出现在180nm左右；中等强度的E2带，出现在204nm左右；强度较弱的B带，出现在255nm。有机溶剂、苯环上的取代基及其取代位置都可能对最大吸收峰的波长、强度和形状产生影响。具有苯环结构的化合物在紫外光区均有较强的特征吸收峰，在苯环上的部分取代基（助色团）使吸收增强，而苯酚在270nm处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯酚的含量成正比，符合Lambert-Beer定律，因此，可用紫外分光光度法直接测定水中总酚的含量。

3、仪器与试剂

3.1 仪器与试剂

仪器： 752型紫外分光光度计 （上海光谱仪器有限公司制造），石英比色皿（25px）2 个，50mL容量瓶，移液管等。

试剂：苯酚标准溶液250 mg·L -1：准确称取0.0250g苯酚于250mL烧杯，加20mL去离子水溶解，移入100mL容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀。

3.2 实验步骤

3.2.1标准系列溶液的配制

取5只50mL容量瓶，分别加入2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL浓度为250 mg·L -1的苯酚标准溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。计算其浓度（mg·L -1）

3.2.2 吸收曲线的测定

取上述标准系列中的任一溶液，用25px石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，在220～350nm波长范围内，扫描绘制吸收曲线。

3.2.3 标准曲线的测定

选择苯酚的最大吸收波长（λmax），用25px石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，按浓度由低到高顺序依次测定苯酚标准溶液的吸光度。

3.2.4 水样的测定

在与上述测定标准曲线相同的条件下，测定水样的吸光度。

4、数据记录与处理

4.1以吸光度为纵坐标，相应六价铬含量为横坐标绘制标准曲线。然后，根据水样吸光度在标准曲线上查出相对应的浓度值，计算出水样中苯酚的含量（g·L-1 ）

GB/T 15351—94

化 学试剂

苯 酚 红

Chemical reagent

Phenol red

本试剂为红色结晶性粉末，易溶于乙醇及碱溶液中，不溶于三氯甲烷及醚中。

示性式：C19H14O5S

结构式：

相对分子质量:354.38（按1991年国际相对原子质量）

1 主题内容与适用范围

本标准规定了化学试剂苯酚红的技术要求、试验方法、检验规则和包装及标志。

本标准适用于化学试剂苯酚红的检验。

2 引用标准

GB/T 601化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备

GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB/T 604化学试剂酸碱指示剂pH变色域测定通用方法

GB/T 619化学试剂采样及验收规则

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 9721化学试剂分子吸收分光光度法通则（紫外和可见光部分）

GB/T 9741化学试剂灼烧残渣测定通用方法

HG 3—119 化学试剂 包装及标志

3技术要求

3.1 pH变色域:

1.2(橙)～3.0(黄)；

6.5(棕黄)～8.0(紫红)。

3.2 最大吸收波长（nm）：

λ1(pH1.2)…………………………………503～506

λ2(pH3.0)…………………………………430～435

λ3(pH6.5)…………………………………430～435

λ4(pH8.0)…………………………………557～560

3.3 质量吸收系数（L/cm•g）：

a1(λ1,pH1.2干样)…………………………………110～123

a2(λ2,pH3.0干样)…………………………………60～68

a3(λ3,pH6.5干样)…………………………………62～72

a4(λ4,pH8.0干样)…………………………………120～135

3.4 杂质最高含量：

%

名 称 指 示 剂

碱溶解试验

干燥失重

灼烧残渣（以硫酸盐计） 合格

1.0

0.2

4试验方法

本试验方法中标准滴定溶液、制剂及制品和pH缓冲溶液，除另有规定外，均按GB/T 601、GB/T 603、GB/T 604之规定制备，实验用水应符合GB/T 6682中三级水规格。

4.1 pH变色域测定

按GB/T 604的规定测定。

4.2 最大吸收波长测定

按GB/T 9721之规定测定，其中：

4.2.1 测定条件

吸收池厚度：1cm；

参比溶液：水。

扫描范围：400～700nm。

4.2.2 测定方法

称取0.100g预先于105±2℃干燥至恒重的试样，精确至0.0001g。加14.20mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.02mol/L]，水浴加热溶解，冷却后，置于500mL容量瓶中，并用无二氧化碳的水稀释至刻度，摇匀。

量取2.00mL、3.00mL、3.00mL、2.00mL上述试样溶液，各置于100mL容量瓶中，分别用pH1.2，pH3.0，pH6.5，pH8.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀。按GB/T 9721中7.2.1条之规定，测量出最大吸收波长及相对应的吸光度A（A用于质量吸收系数的计算）。

4.3 质量吸收系数

质量吸收系数按式（1）计算：

a = A ……………………………………(1)

b•c

式中：a----质量吸收系数,L/cm•g

A----4.2.2条中所测得的吸光度；

b----吸收池厚度，cm

c----试样溶液的浓度，g/L

4.4 杂质测定

试样称量须精确至0.01g。

4.4.1 碱溶解试验

称取0.1g样品，加0.3mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1mol/L]溶解，稀释至250mL，应全溶清亮，无机械杂质。

4.4.2干燥失重

称取1g样品，精确至0.0001g，置于已在105±2℃干燥至恒重的称量瓶中，于105±2℃的电烘箱中干燥至恒重。

干燥失重按式（2）计算：

X = m1－m2 ×100 …………………………(2)

m1

式中：X----干燥失重，%；

m1----恒重前样品的质量，g；

m2----恒重后样品的质量，g；

4.4.3灼烧残渣

称取0.5g样品，按GB/T 9741中4.1条之规定测定。结果按GB/T 9741中第5章 之规定计算。

5检验规则

按GB/T 619的规定进行采样及验收。

6 包装及标志

按HG 3—119的规定，其中：

内包装形式：Gz-3；

外包装形式：W-1；

包装单位：第2类。

附加说明：

本标准由中华人民共和国化学工业部提出。

本标准由北京化学试剂总厂归口。

本标准由北京化工厂负责起草。

本标准主要起草人郝玉林、关瑞宝、强京林、刘冬霓。

本标准自实施之日起，原化学工业部部标准HG 3—957—76《化学试剂 苯酚红》作废。

一、实验目的

1、了解酚污染对水环境的影响。

2、 掌握用萃取比色法和直接光度法测定酚的原理和操作技术。

二、实验原理

酚是水体中的重要污染物，会影响水生生物的正常生长，使水产品发臭。水中酚含量超过0.3毫克/升时，可引起鱼类的回避。水体中酚的种类较多，部分酚可以挥发，本实验仅测定可被蒸馏的挥发酚。

在碱性条件和氧化剂铁氰化钾作用下，酚类与4-氨基安替比林反应，生成桔红色的吲哚酚安替比林染料，在510nm处有最大吸收。若用氯仿萃取此染料，可以增加颜色的稳定性，提高灵敏度，在460nm处有最大吸收。

该方法可测定苯酚及邻、间位取代的酚，但不能测定对位有取代基的酚。由于样品中各种酚的相对含量不同，因而不能提供一个含混合酚的通用标准。通常选用苯酚作标准，任何其它酚在反应中产生的颜色都看作苯酚的结果。取代酚一般会降低响应值，因此，用该方法测出的值仅代表水样中挥发酚的最低浓度。

三、仪器和试剂

1．721型分光光度计及1厘米和3厘米比色皿

2．500毫升全玻璃蒸馏器

3．无酚水

本实验均用无酚水，制备方法如下：

（1）置水于全玻璃磨口蒸馏器内，加氢氧化钠溶液至强碱性，滴加高锰酸钾溶液至深紫色，加热蒸馏，馏出液贮于硬质玻璃瓶中。

（2）于每升重蒸馏水中加入 0.2克活性炭，充分振摇，放置过夜，过滤，贮于硬质玻璃瓶中。

4．硫酸铜溶液

称取100克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于1升水中。

5．磷酸溶液

量取10.0毫升85%的磷酸溶液用水稀释至100毫升。

6．0.02M 溴酸钾-溴化钾溶液

称取3.2克无水溴酸钾溶于水中，加入10克溴化钾，溶解后移入1000毫升容量瓶内，稀释至刻度。

7．0.0250M硫代硫酸钠标准溶液

称取6.2克硫代硫酸钠，溶于1升煮沸后冷却的水中，加入0.4克氢氧化钠，贮于棕色瓶内，标定方法如下：

于250毫升碘量瓶中加入100毫升水、1.0克碘化钾、10毫升0.0250M重铬酸钾溶液和5毫升3M硫酸，摇匀，加塞后置于暗处5分钟，用待标定的硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色。然后加入1%淀粉溶液1.0毫升，继续滴定至蓝色刚好消失，记录用量，平行做三份。

硫代硫酸钠溶液的摩尔M1为：M1=2×M2×V2/V1

8．酚标准贮备液

称取1.0克苯酚溶于煮沸后冷却的水中，稀释至1升。按下法标定：

取10.00毫升酚贮备液于250毫升碘量瓶中，加入100毫升水，10.00亳升0.02M溴酸钾—溴化钾溶液，立即加入5亳升浓盐酸，盖好瓶塞，摇匀，于暗处静置10分钟，加入1克碘化钾摇匀，5分钟后，用0.0250M硫代硫酸钠滴定呈淡黄色，再加1毫升淀粉溶液，继续滴定呈蓝色刚好消失，记录用量。用水代替酚贮备液，做空白滴定，记录用量。

酚标准贮备液（毫克/毫升）=（A-B）×M/V×（94/6）

式中：

A为空白滴定值（毫升）；

B为滴定体积（毫升）；

M为硫代硫酸钠摩尔浓度；

V为贮备酚溶液体积（10.00毫升）；

94为苯酚的摩尔质量（克）。

9．酚标准中间液

将酚标准贮备液稀释至浓度为0.10毫克/毫升。

10．酚标准使用液

吸取5.00毫升酚标准中间液于500毫升容量瓶中，用煮沸后冷却的水稀释至刻度，此溶液含酚量为1.00微克/毫升。用前2小时配制。

11．缓冲溶液

称取20克氯化氨溶于100毫升浓氨水中，调节pH 为9.8。

12．4—氨基安替比林溶液

称取2.0克4—氨基安替比林溶于水中，稀释到100毫升，用时配制。该溶液贮于棕色瓶内，在冰箱中可保存一周。

13．铁氰化钾溶液

称取8.0克铁氰化钾溶于100毫升水中，可保存一周。

14．氯仿

四、实验步骤

1.预蒸馏

量取250亳升待测水样于蒸馏瓶中，加两滴甲基橙指示剂，用磷酸溶液水样调呈橙红色（此时pH约为4）。加入5.0毫升硫酸铜溶液（如取样时已加过，则不必再加）及数粒玻璃珠，加热蒸馏，以250亳升量筒或容量瓶收集馏出液。待蒸馏出约225毫升后，停止加热。液面静止后，加入25毫升水，继续蒸馏到馏出液250毫升为止。

2．萃取比色法

（1）将250毫升馏出液转入500毫升分液漏斗中，或用移液管取部分馏出液稀释到250亳升，使溶液的酚含量不大于15微克。

（2）分别取酚的标准使用液0,0.50,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,15.00毫升，用250毫升煮沸后冷却的水稀释，移入 500毫升分液漏斗中。

（3）在分液漏斗内依次加入2毫升缓冲溶液，1.5毫升4-氨基安替比林溶液，混匀，加入1.5毫升铁氰化钾溶液，再混匀。静置10分钟显色。

（4）分别加入13.00毫升氯仿，剧烈振摇2分钟萃取，静置分层。

（5）擦干分液漏斗的导管内壁，塞入一小团脱脂棉，将有机相直接放入比色皿中。

（6）在460nm波长处，以氯仿为参比，用3厘米比色皿测定各标准系列的吸光度，绘制标准曲线。同时测定样品的吸光度，从标准曲线上查出对应的含酚量。

标准系列和样品的吸光度都应扣除试剂的空白值。

3．直接光度法

水样含酚浓度在0.1—5毫克/升时，可采用此法。

（1）绘制标准曲线

于50亳升比色管中分别加入0,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50毫升酚标准中间液，加入0.5毫升缓冲溶液，1毫升4—氨基安替比林溶液，混匀。加入1毫升铁氰化钾溶液，用水稀释到50毫升，再混匀。放置15分钟后，于510nm波长处，用1厘米比色皿，以试剂空白为参比，测定吸光度。绘制标准曲线。

（2）水样测定

取50毫升馏出液（含酚量小于0.25毫克）或分取适量馏出液用水稀释到50毫升，置于比色管中，按标准系列的步骤操作，测定吸光度。

五、数据处理

酚（毫克/升）=测得的酚含量/水样的体积

六、注意事项

1．水样中的酚不稳定，易挥发和氧化，并受微生物作用而损失。因此，水样采集后应加氢氧化钠保存剂，并尽快测定。

2．氧化性，还原性物质，金属离子及芳香胺类化合物对于测定有干扰，预蒸馏可除去大多数干扰物。但对污染严重的水样，蒸馏前要用下述方法消除干扰物：

（1）除氧化剂

加入碘化钾和酸后如游离出碘，说明有氧化剂存在。这时可用过量的硫酸亚铁和亚砷酸钠除去。

（2）除硫化物

用磷酸调节水样pH=4，搅拌曝气，除去二氧化硫及硫化氢。

（3）除油类

用浓氢氧化钠溶液调节水样pH为12—13，以四氯化碳提取油类，弃去有机相。加热蒸去水相中残余的四氯化碳。

3、 一次蒸馏足以净化样品。若出现馏出液浑浊，需用磷酸酸化后再蒸馏。

4、 样品和标准溶液中加入缓冲液和4—氨基安替比林后要混匀才能加入铁氰化钾，否则结果偏低。

5、 萃取比色法中，试剂空白以氯仿为参比的吸光度应在0.10以下，否则4—氨基安替比林溶液应重新配制或采用新出厂产品。

6、 当苯酚试剂呈红色时，则需对苯酚精制。方法如下：

取在水浴上融化后的苯酚，置于适量的蒸馏瓶中，插入250℃温度计，加热蒸馏，空气冷凝，注意保温，收集182--184℃的馏份。精制的苯酚冷却后，应为无色，低温时析出结晶，贮于暗处。

苯酚含有苯环，具有由π→π*跃迁产生的三个特征吸收谱带。由于-oh的取代，吸收峰红移。从而使π*轨道的能量降低。首先在文献上查的苯酚的紫外吸收光谱数据，找出苯酚的入max并根据公式lg a=lg k+lg bc与其相对应的吸光度的比值，与所查数据进行对照，进行入max及吸光度比值比较，看其是否一致。【仪器与试剂】

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