乙醇脱色为什么是20-25秒

晚上好，一般来说是这样。无水乙醇对于很多染料和有色化合物都有较强溶解能力类似甲醇，一些只是单纯靠溶剂自干挥发所附着在物体表面显色的色素可以被重新溶解下来，也可以作为萃取像是叶绿素和花青素等天然色素的良好溶剂。不过通常情况下由于极性质子溶剂对亲水染料分子溶解力较好也只有醇和胺易溶，换成丙酮、乙二醇乙醚或者THF等溶剂虽然也能溶于水但对色素兼容力就大打折扣了。

应该是：

酒精是有机溶剂，可以溶解有机物等的溶质。例如叶片的脱色处理，在其里面的叶绿素给酒精溶解，所以才是所谓的“脱色”之说。

纯手打，不解释。望帮到你

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。 另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

革兰氏染色原理：

G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）自来水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。

7）蕃红染色液（稀）（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

因此染色、脱色、固定等步骤的时间控制比较重要，需要对比试验，得出最适时间。

细菌细胞通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色的步骤

涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脱色、复染。具体操作请点击

影响革兰氏染色结果准确性的关键因素

试剂影响

我们使用的试剂必须是有效的。实验室应当建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存放、使用、过期后的废弃处理都应有严格规定，确保我们使用的试剂是有效的。

染色菌的选择

菌龄对革兰氏染色结果的影响是十分大的。我们染色过程中选择的菌应该是处于活跃生长期，这样的细菌活性强，生理特征明显，所以染色的结果准确度高，一般情况下不会出现误差。培养时间较长的革兰氏阳性菌，由于细胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已经死亡或者自行溶解了，造成细胞壁通透性增加，就会呈现出假阴性。以金黄色葡萄球菌为例，金葡是典型的革兰氏阳性菌，有人曾经统计过培养至不同时间的金葡的革兰氏染色结果，结果表明，在金葡活跃期的22h-26h之间，染色结果的准确率基本可以达到100%，而超过26h之后，准确率就开始下降，培养至36h时，准确率大概会下降30%左右。所以我们在染色时，一定要选择处于活跃期、活性较强的菌落，在检测过程中一定要严格的在国标要求的时间段内进行染色试验，不能提前或者延后。

涂菌的状态

在染色最初的涂布中，在挑取菌体后应该在无菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布过程中，若是菌体堆积，也会极大影响染色结果的准确性。菌落堆积过多，往往菌体之间变得毫无缝隙，而其细胞壁的成分影响造成了脱色的情况不佳，容易产生假阳性的结果。同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染液覆盖整个菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌没有染色。因此在涂片过程一定要将菌膜涂得少而均匀，这样能达到最佳效果。

脱色。乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。

革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。

染色原理：

通过初染和媒染后，细胞内形成了不溶于水的结晶紫一碘大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上它基本不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙。

因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在细胞壁内，使其呈现紫色。而革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大缝隙，复合物容易溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又成无色。

这时再用红色染料进行复染，革兰氏阴性细菌将获得一层新的颜色——红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。

阳性乙醇脱色后复染之前，已经是紫色的了，阴性的成了无色。

然后再复染，此时G+是紫加红，也就是显紫色，G-红色。

介绍过程:

1)涂片固定。

2)草酸铵结晶紫染1分钟。

3)自来水冲洗。

4)加碘液覆盖涂面染约1分钟。

5)水洗，用吸水纸吸去水分。

6)加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

7)蕃红染色液(稀)或沙红染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

琼脂培养基不凝固的原因：

1,ph值不准确,偏酸

2,消毒时间过长,破坏了琼脂的凝固质

3,琼脂质量的问题

4,消毒后若还是长时间放在高温地方同样不凝固(比较小有这种情况)

5,单位容量的比例值,依琼脂的质量而言是每升用6.2-6.8克不等

酒精的作用具体叫洗去浮色，之所以使用酒精是因为酒精是良好的有机溶剂，很多有机染剂都可以溶解在酒精里被洗去

革兰氏染色为什么一定要用95%的酒精脱色，当以95％酒精脱色时，脂类被溶去，使细胞壁孔隙变大，尽管95％酒精处理能使肽聚糖孔隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，细胞壁缩小有限，故能让结晶紫(或龙胆紫)与碘形成的紫色染料复合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。而革兰氏阳性细菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经95％酒精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫(或龙胆紫)与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。